Cre/loxP 방법을 이용한 전압의존성 L형 칼슘채널 알파 IC 유전자의 도건부 결손 생쥐 제조 Conditional Knockout of the Voltage Dependent L-type Calcium Channel α1C (Cav 1.2) Gene in Mice Using the Cre/loxP System원문보기
전압의존성 칼슘채널은 세포막의 탈 분극화에 반응하여 여러 가지 세포내 과정을 조절하는데, 근육세포에서의 수축작용, 내분비세포에서의 분비작용, 신경세포 말단에서의 신경전달물질 분비, 그리고 여러 유전자의 발현 조절 등에 관여한다고 알려져 있다. 칼슘채널은 α₁, β , α₂δ , 및 γ subunits으로 구성되어 있으며 그 중 α₁ subunit이 가장 크고 voltage sensor, selectivity filter, ion conducting pore 및 칼슘채널 차단제의 ...
전압의존성 칼슘채널은 세포막의 탈 분극화에 반응하여 여러 가지 세포내 과정을 조절하는데, 근육세포에서의 수축작용, 내분비세포에서의 분비작용, 신경세포 말단에서의 신경전달물질 분비, 그리고 여러 유전자의 발현 조절 등에 관여한다고 알려져 있다. 칼슘채널은 α₁, β , α₂δ , 및 γ subunits으로 구성되어 있으며 그 중 α₁ subunit이 가장 크고 voltage sensor, selectivity filter, ion conducting pore 및 칼슘채널 차단제의 수용체 등을 포함한다. 칼슘채널은 전압 및 시간의존성, 생리학적 및 약리학적 특성의 차이에 따라 여러 가지 type으로 나뉘고, 그 중 고전압에 의해 활성화되는 L-type 칼슘채널의 α₁ subunit에는 α_1S(Cav1.1), α_1C(Cav1.2), α_1D(Cav1.3), 와 α_1F(Cav1.4) subtype이 있다. Cav1.2 유전자는 심근과 펑활근의 주요 L-type 칼슘채널로서 정상적인 심장리듬의 생성 및 전도, 심근수축에 필수적이며, 자궁 및 혈관 평활근의 수축, 뇌에서의 신경전달, 췌장 및 부신에서의 호르몬 분비 등의 과정에 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 L-type 칼슘채널 Cav1.2의 다양한 조직 내에서의 생리적 기능을 규명하기 위해 유전자 적중법(gene targeting)을 이용하여 변형시키기로 하였다. 그러나 Cav1.2는 생명유지에 필수적인 역할을 하고 있어서 유전자를 완전히 없애게 되면 태생기 14.5일 이내에 사망하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 conditional knockout 방법 중 특정세포 또는 특정조직에서만 유전자를 적중시킬 수 있는 것으로 알려진 Cre/loxP 방법을 이용하여 Cav1.2 유전자를 적중하기로 하였다. Cre/loxP 방법은 bacteriophage P1의 cre (cyclization recombination) 유전자의 산물인 Cre recombinase가 두개의 loxP (locus of X-over P1)를 인지하고 그 사이에 있는 DNA를 제거해내는 점을 이용한 것으로, 적중시키고자 하는 유전자 양쪽에 loxP를 오게 하고 세포 또는 조직 특이 promotor에 의해 발현되는 Cre 생쥐와 교배시킴으로써 특정세포 또는 특정조직에서만 유전자를 적중시킬 수 있는 방법이다. 변형할 Cav1.2 유전자를 포함하는 genomic DNA를 얻기 위해 129/sv 생쥐의 bacteriophage FIX II genomic DNA library를 screening하였고, 여기서 얻은 DNA를 가지고 유전자 적중벡터를 제작하였다. 벡터는 Neo/HSV-TK cassette와 세 개의 loxP를 포함하게 하였는데 exon 5의 downstream intron에 두 개의 loxP사이에 낀 Neo/HSV-TK cassette를 삽입하였고 다른 하나의 loxP는 exon 5의 upstream intron에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 적중 벡터(α_1C-CKO)를 전 분화능력을 갖는 배아간세포에 electroporation을 통해서 도입하였으며, G418을 처리한 후 살아남은 클론들을 골라내어 genomic Southern blot 분석을 통해서 그 유전자 부위가 homologous recombination에 의해 적중된 클론들을 선별하였다. 염색체 분석을 통해서 높은 euploid를 보이는 적중 클론 배아간세포들을 임신 3.5 일된 C57BL/6J 생쥐의 자궁에서 채취한 포배배아(blastocyst)에 미세주입 한 후, 가임신된 생쥐의 자궁에 착상 시켰다. 여기서 두 마리의 카이메라 생쥐를 얻을 수 있었고 Cav1.2 유전자 중 하나가 변형된 heterozygote를 얻기 위해서, 이 카이메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배 시켜 germline으로 간 새끼를 생산 중이다.
전압의존성 칼슘채널은 세포막의 탈 분극화에 반응하여 여러 가지 세포내 과정을 조절하는데, 근육세포에서의 수축작용, 내분비세포에서의 분비작용, 신경세포 말단에서의 신경전달물질 분비, 그리고 여러 유전자의 발현 조절 등에 관여한다고 알려져 있다. 칼슘채널은 α₁, β , α₂δ , 및 γ subunits으로 구성되어 있으며 그 중 α₁ subunit이 가장 크고 voltage sensor, selectivity filter, ion conducting pore 및 칼슘채널 차단제의 수용체 등을 포함한다. 칼슘채널은 전압 및 시간의존성, 생리학적 및 약리학적 특성의 차이에 따라 여러 가지 type으로 나뉘고, 그 중 고전압에 의해 활성화되는 L-type 칼슘채널의 α₁ subunit에는 α_1S(Cav1.1), α_1C(Cav1.2), α_1D(Cav1.3), 와 α_1F(Cav1.4) subtype이 있다. Cav1.2 유전자는 심근과 펑활근의 주요 L-type 칼슘채널로서 정상적인 심장리듬의 생성 및 전도, 심근수축에 필수적이며, 자궁 및 혈관 평활근의 수축, 뇌에서의 신경전달, 췌장 및 부신에서의 호르몬 분비 등의 과정에 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 L-type 칼슘채널 Cav1.2의 다양한 조직 내에서의 생리적 기능을 규명하기 위해 유전자 적중법(gene targeting)을 이용하여 변형시키기로 하였다. 그러나 Cav1.2는 생명유지에 필수적인 역할을 하고 있어서 유전자를 완전히 없애게 되면 태생기 14.5일 이내에 사망하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 conditional knockout 방법 중 특정세포 또는 특정조직에서만 유전자를 적중시킬 수 있는 것으로 알려진 Cre/loxP 방법을 이용하여 Cav1.2 유전자를 적중하기로 하였다. Cre/loxP 방법은 bacteriophage P1의 cre (cyclization recombination) 유전자의 산물인 Cre recombinase가 두개의 loxP (locus of X-over P1)를 인지하고 그 사이에 있는 DNA를 제거해내는 점을 이용한 것으로, 적중시키고자 하는 유전자 양쪽에 loxP를 오게 하고 세포 또는 조직 특이 promotor에 의해 발현되는 Cre 생쥐와 교배시킴으로써 특정세포 또는 특정조직에서만 유전자를 적중시킬 수 있는 방법이다. 변형할 Cav1.2 유전자를 포함하는 genomic DNA를 얻기 위해 129/sv 생쥐의 bacteriophage FIX II genomic DNA library를 screening하였고, 여기서 얻은 DNA를 가지고 유전자 적중벡터를 제작하였다. 벡터는 Neo/HSV-TK cassette와 세 개의 loxP를 포함하게 하였는데 exon 5의 downstream intron에 두 개의 loxP사이에 낀 Neo/HSV-TK cassette를 삽입하였고 다른 하나의 loxP는 exon 5의 upstream intron에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 적중 벡터(α_1C-CKO)를 전 분화능력을 갖는 배아간세포에 electroporation을 통해서 도입하였으며, G418을 처리한 후 살아남은 클론들을 골라내어 genomic Southern blot 분석을 통해서 그 유전자 부위가 homologous recombination에 의해 적중된 클론들을 선별하였다. 염색체 분석을 통해서 높은 euploid를 보이는 적중 클론 배아간세포들을 임신 3.5 일된 C57BL/6J 생쥐의 자궁에서 채취한 포배배아(blastocyst)에 미세주입 한 후, 가임신된 생쥐의 자궁에 착상 시켰다. 여기서 두 마리의 카이메라 생쥐를 얻을 수 있었고 Cav1.2 유전자 중 하나가 변형된 heterozygote를 얻기 위해서, 이 카이메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배 시켜 germline으로 간 새끼를 생산 중이다.
Gene targeting allowed the analysis of the functional relevance of the L-type Cav1.2 calcium channel for various tissues in vivo. However, conventional disruption of the Cav1.2 gene in mice resulted in embryonal death before day 14.5 p.c. in homozygote (-/-). Therefore, Cre/loxP sytem was used in th...
Gene targeting allowed the analysis of the functional relevance of the L-type Cav1.2 calcium channel for various tissues in vivo. However, conventional disruption of the Cav1.2 gene in mice resulted in embryonal death before day 14.5 p.c. in homozygote (-/-). Therefore, Cre/loxP sytem was used in this study for tissue-specific gene targeting. Cre/loxP system is a phage P1-derived site-specific recombination system in which the Cre recombinase catalyzes recombination between loxP recognition sequences. Target exon flanked by two loxP sequences could be deleted tissue specifically by mating with transgenic mice that express Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. Mouse genomic DNA containing the Cav1.2 locus was obtained by screening a bacteriophage FIX II (stratagene) library of 129/sv mouse genomic DNA. The targeting vector designed that contains a Neo/HSV-TK cassette and three loxP sequences. Two loxP sites flank the Neo/HSV-TK cassette, which is located in the intron downstream of exon 5. The third loxP site is located in the intron between exons 4 and 5. The linearized targeting vector (NotI digested α_lC -CKO vector) was electroporated into ES cells. Electorporatcd ES cells were selected with G418 and G418-resistant colonies were picked.
Gene targeting allowed the analysis of the functional relevance of the L-type Cav1.2 calcium channel for various tissues in vivo. However, conventional disruption of the Cav1.2 gene in mice resulted in embryonal death before day 14.5 p.c. in homozygote (-/-). Therefore, Cre/loxP sytem was used in this study for tissue-specific gene targeting. Cre/loxP system is a phage P1-derived site-specific recombination system in which the Cre recombinase catalyzes recombination between loxP recognition sequences. Target exon flanked by two loxP sequences could be deleted tissue specifically by mating with transgenic mice that express Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. Mouse genomic DNA containing the Cav1.2 locus was obtained by screening a bacteriophage FIX II (stratagene) library of 129/sv mouse genomic DNA. The targeting vector designed that contains a Neo/HSV-TK cassette and three loxP sequences. Two loxP sites flank the Neo/HSV-TK cassette, which is located in the intron downstream of exon 5. The third loxP site is located in the intron between exons 4 and 5. The linearized targeting vector (NotI digested α_lC -CKO vector) was electroporated into ES cells. Electorporatcd ES cells were selected with G418 and G418-resistant colonies were picked.
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