장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)의 유충으로부터 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 효소를 분리, 정제하여 그 특성을 규명하였다. 이 효소를 정제하기 위하여 첫 단계에서 3령기를 지난 장수풍뎅이 유충을 파쇄하여 얻은 조단백질을 포화농도 20-70%의 황산암모늄으로 농축시켰으며, Sephadex G-150 겔 여과 크로마토그래피와 HiTrap-Q HP 을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 방법을 순차적으로 사용하였다. 정제한 단백질은 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과 39 kDa 크기의 한 개의 ...
장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)의 유충으로부터 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 효소를 분리, 정제하여 그 특성을 규명하였다. 이 효소를 정제하기 위하여 첫 단계에서 3령기를 지난 장수풍뎅이 유충을 파쇄하여 얻은 조단백질을 포화농도 20-70%의 황산암모늄으로 농축시켰으며, Sephadex G-150 겔 여과 크로마토그래피와 HiTrap-Q HP 을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 방법을 순차적으로 사용하였다. 정제한 단백질은 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과 39 kDa 크기의 한 개의 폴리펩타이드로 이루어졌음을 확인하였다. 이 단백질 분해효소의 최적 온도와 pH는 각각 37℃와 7.5이었다. 분리한 단백질 분해효소는 활성을 나타내는데 칼슘 이온을 필요로 하지 않았으며, PMSF, APMSF 등과 같은 세린 단백질 분해효소 저해제에 의해 활성이 억제되었다. 이러한 결과로부터 이 단백질 분해효소가 Ca^(2+)에 비의존적인 세린 단백질 분해효소 계통의 효소임을 알수 있었다. 효소활성 분석에 사용한 여러 가지 합성 기질 중에서 전형적인 혈액응고 인자 Xa의 기질인 S-2222가 가장 적합한 기질로 사용됨을 확인함으로써 분리한 효소가 혈액응고 인자 Xa와 유사한 활성을 지닌 프로트롬빈 활성화 효소임을 알 수 있었다. 정제한 효소가 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는지 확인하기 위하여 fibrinogen-agarose plate 상에서 turbid ring 형성 시험을 수행하였으며, 프로트롬빈으로부터 트롬빈의 생성여부를 SDS-polyacrylamide gel에서 확인하였다. 실험결과, 정제한 효소는 fibrinogen-agarose plate 상에서 강한 turbid ring을 형성하였고, 프로트롬빈을 분해하여 트롬빈을 생성시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 정제한 단백질 분해효소가 프로트롬빈을 가수분해시켜 활성을 가지는 트롬빈을 생성시키고, 생성된 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 분해시킴을 의미하는 것이다. 본 연구에서는 또한 정제한 효소가 혈액응고 인자 Xa의 경우처럼 트롬빈 저해제인 antithrombin Ⅲ에 의해 효소활성이 억제 되는지를 검토하였다. S-2222를 기질로 한 실험결과, 정제한 효소의 활성이 antithrombin Ⅲ에 의해 억제됨을 확인하였으며, prothrombin time (PT) 에 미치는 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 PT가 짧아짐을 확인함으로서 피브린 교차연결에 관여함을 확인하였다. 본 연구에서 얻은 이상의 결과로부터 정제한 효소는 칼슘 이온에 비의존적인 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 세린 단백질 분해효소 계통의 단백질 분해 효소임을 확인하였다.
장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)의 유충으로부터 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 효소를 분리, 정제하여 그 특성을 규명하였다. 이 효소를 정제하기 위하여 첫 단계에서 3령기를 지난 장수풍뎅이 유충을 파쇄하여 얻은 조단백질을 포화농도 20-70%의 황산암모늄으로 농축시켰으며, Sephadex G-150 겔 여과 크로마토그래피와 HiTrap-Q HP 을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 방법을 순차적으로 사용하였다. 정제한 단백질은 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과 39 kDa 크기의 한 개의 폴리펩타이드로 이루어졌음을 확인하였다. 이 단백질 분해효소의 최적 온도와 pH는 각각 37℃와 7.5이었다. 분리한 단백질 분해효소는 활성을 나타내는데 칼슘 이온을 필요로 하지 않았으며, PMSF, APMSF 등과 같은 세린 단백질 분해효소 저해제에 의해 활성이 억제되었다. 이러한 결과로부터 이 단백질 분해효소가 Ca^(2+)에 비의존적인 세린 단백질 분해효소 계통의 효소임을 알수 있었다. 효소활성 분석에 사용한 여러 가지 합성 기질 중에서 전형적인 혈액응고 인자 Xa의 기질인 S-2222가 가장 적합한 기질로 사용됨을 확인함으로써 분리한 효소가 혈액응고 인자 Xa와 유사한 활성을 지닌 프로트롬빈 활성화 효소임을 알 수 있었다. 정제한 효소가 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는지 확인하기 위하여 fibrinogen-agarose plate 상에서 turbid ring 형성 시험을 수행하였으며, 프로트롬빈으로부터 트롬빈의 생성여부를 SDS-polyacrylamide gel에서 확인하였다. 실험결과, 정제한 효소는 fibrinogen-agarose plate 상에서 강한 turbid ring을 형성하였고, 프로트롬빈을 분해하여 트롬빈을 생성시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 정제한 단백질 분해효소가 프로트롬빈을 가수분해시켜 활성을 가지는 트롬빈을 생성시키고, 생성된 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 분해시킴을 의미하는 것이다. 본 연구에서는 또한 정제한 효소가 혈액응고 인자 Xa의 경우처럼 트롬빈 저해제인 antithrombin Ⅲ에 의해 효소활성이 억제 되는지를 검토하였다. S-2222를 기질로 한 실험결과, 정제한 효소의 활성이 antithrombin Ⅲ에 의해 억제됨을 확인하였으며, prothrombin time (PT) 에 미치는 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 PT가 짧아짐을 확인함으로서 피브린 교차연결에 관여함을 확인하였다. 본 연구에서 얻은 이상의 결과로부터 정제한 효소는 칼슘 이온에 비의존적인 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 세린 단백질 분해효소 계통의 단백질 분해 효소임을 확인하였다.
A novel prothrombin activating enzyme was purified and characterized from the larva of Allomyrina dichotoma. The crude extracts from larva of A. dichotoma were concentrated with ammonium sulfate ranging from 20 to 70% and the pretense was purified through by a gel filtration with Sephadex G-f5O colu...
A novel prothrombin activating enzyme was purified and characterized from the larva of Allomyrina dichotoma. The crude extracts from larva of A. dichotoma were concentrated with ammonium sulfate ranging from 20 to 70% and the pretense was purified through by a gel filtration with Sephadex G-f5O column and finally an anion exchange chromatography with HiTrap-Q column. The purified protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 39 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal temperature and pH for the enzymatic catalysis were 37℃ and 7.5, respectively. The Ca^(2+) ion could not affect the activity, suggesting that the puried protease is a Ca^(2+)-independent prothrombin activating enzyme. In addition, the enzyme activity was clearly inhibited by PMSF and APMSF, suggesting that it is a member of the serine proteases. Among the chromogenic substrates tested, S-2222 (Bz-IIe-GIu-(-OR)-Gly-Arg-pNA) that is a typical substrate for Factor Xa was the most favorable one for the purified enzyme. It was revealed by the turbid ring formation assay on fibrinogen-agarose plate and by the prothrombin cleavage assay on SDS-polyacrylamide gel that the purified protein actually cleaved prothrombin to an active thrombin, leading fibrinogen cleavage to form a cross-liked fibrin at nanomolar range. The thrombin produced from prothrombin by the purified enzyme was inhibited by antithrombin Ⅲ. The degradation pattern of prothrombin by the purified enzyme was very similar to that by Factor Xa as well. The purified protease actively decreased the clotting time (PT) in a concentration-dependent manner is that the PT was much more extended, when the enzyme activity was tested with antithrombin Ⅲ using S-2222 as a substrate. This result suggent that the thrombin derived from prothrombin by the purified enzyme is actual one. All these results reported by the present study strongly suggest that the purified protease is a Ca^(2+)-independent prothrombin activating enzyme belonging to the family of serine protease.
A novel prothrombin activating enzyme was purified and characterized from the larva of Allomyrina dichotoma. The crude extracts from larva of A. dichotoma were concentrated with ammonium sulfate ranging from 20 to 70% and the pretense was purified through by a gel filtration with Sephadex G-f5O column and finally an anion exchange chromatography with HiTrap-Q column. The purified protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 39 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal temperature and pH for the enzymatic catalysis were 37℃ and 7.5, respectively. The Ca^(2+) ion could not affect the activity, suggesting that the puried protease is a Ca^(2+)-independent prothrombin activating enzyme. In addition, the enzyme activity was clearly inhibited by PMSF and APMSF, suggesting that it is a member of the serine proteases. Among the chromogenic substrates tested, S-2222 (Bz-IIe-GIu-(-OR)-Gly-Arg-pNA) that is a typical substrate for Factor Xa was the most favorable one for the purified enzyme. It was revealed by the turbid ring formation assay on fibrinogen-agarose plate and by the prothrombin cleavage assay on SDS-polyacrylamide gel that the purified protein actually cleaved prothrombin to an active thrombin, leading fibrinogen cleavage to form a cross-liked fibrin at nanomolar range. The thrombin produced from prothrombin by the purified enzyme was inhibited by antithrombin Ⅲ. The degradation pattern of prothrombin by the purified enzyme was very similar to that by Factor Xa as well. The purified protease actively decreased the clotting time (PT) in a concentration-dependent manner is that the PT was much more extended, when the enzyme activity was tested with antithrombin Ⅲ using S-2222 as a substrate. This result suggent that the thrombin derived from prothrombin by the purified enzyme is actual one. All these results reported by the present study strongly suggest that the purified protease is a Ca^(2+)-independent prothrombin activating enzyme belonging to the family of serine protease.
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