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식물체 내에서의 다양한 물질이동은 특정조직 내에 존재하는 유전자가 세포내의 여러 factor 들의 도움을 받아 수행하고 있다. 조직 상호간의 수평적 물질이동의 경우, 물질의 집합체인 vesicle 형태로 만들어서 donor compartment에서 target compartment로 물질을 전달한다. donor membrane으로부터 분리된 vesicle이 target membrane에 이르러 fusion이 일어나기 위해서는 그 vesicle을 인식할 수 있는 인식 유전자들이 Donor와 target membrane간에 필요하게 되는데, 이 중 transport vesicle 상에 존재하는 유전자를 V(vesicle)-SNARE라 하고, target membrane 상에 존재하는 유전자를 T(target)-SNARE라고 부른다. 이러한 v-SNARE와 t-SNARE가 정확한 상호작용에 의한 transport vesicle 과 target membrane의 바른 fusion을 통해 이동물질은 제대로 전달되게 된다. 본 연구에서는 세포 내 기관 중 하나인 vacuole로의 vesicle-mediated targeting을 연구하기 위해 벼로부터 t-SNARE로써 분리한 OsVam3p를 사용하였다. Rice에서의 vacuolar targeting을 연구하기 위해서 ...

식물체 내에서의 다양한 물질이동은 특정조직 내에 존재하는 유전자가 세포내의 여러 factor 들의 도움을 받아 수행하고 있다. 조직 상호간의 수평적 물질이동의 경우, 물질의 집합체인 vesicle 형태로 만들어서 donor compartment에서 target compartment로 물질을 전달한다. donor membrane으로부터 분리된 vesicle이 target membrane에 이르러 fusion이 일어나기 위해서는 그 vesicle을 인식할 수 있는 인식 유전자들이 Donor와 target membrane간에 필요하게 되는데, 이 중 transport vesicle 상에 존재하는 유전자를 V(vesicle)-SNARE라 하고, target membrane 상에 존재하는 유전자를 T(target)-SNARE라고 부른다. 이러한 v-SNARE와 t-SNARE가 정확한 상호작용에 의한 transport vesicle 과 target membrane의 바른 fusion을 통해 이동물질은 제대로 전달되게 된다. 본 연구에서는 세포 내 기관 중 하나인 vacuole로의 vesicle-mediated targeting을 연구하기 위해 벼로부터 t-SNARE로써 분리한 OsVam3p를 사용하였다. Rice에서의 vacuolar targeting을 연구하기 위해서 yeast Vam3p의 rice homologue를 genome data base를 이용하여 분리하였다. 분리된 gene은 280개의 amino acid를 encoding 하며, 30.5 kDa의 M.W.을 가질 것으로 예상되었다. 우리는 이 gene을 Oryza sativa vam3라 하여 Osvam3로 명명하였다. OsVam3p는 C-terminus에 protein-protein interaction 에 중요한 역할을 할 것으로 예상되는 SNARE motif와 membrane attachment에 기능을 하는 것으로 알려져 있는 transmembrane domain(TMD)이 존재하고 있었다. Osvam3 유전자는 rice genome상에 single copy로 존재하며, 여러 조직에서 발현 가능할 것으로 판단되는 data를 얻었다. 또한 OsVam3p의 기능을 알아보기 위해서 yeast vam3 null mutant를 이용하여 complementation test를 실시하였다. 그 결과 vam3가 deletion된 mutant에서의 vacuolar morphology는 비정상적인 small vacuole-like structure를 나타내었고, vacuolar sorting protein인 CPY의 sorting기능이 저해된 반면에, rice의 vam3가 yeast의 mutant cell line에 transformation되었을 때는 정상적인 large vacuolar morphology로 복원 되었으며, CPY에 의한 sorting역시 정상으로 이루어졌다. 이것으로 rice의 vam3와 yeast의 vam3가 유사한 기능을 수행할 것으로 판단되었다. 또한 OsVam3p의 subcellular localization을 알아 보기 위해 GFP-fused form을 Arabidopsis protoplasts에 transformation하였다. 그 결과 GFP signal 이 vacuolar membrane-like staining pattern과 punctuate staining pattern으로 나타났다. 그리고 OsVam3p의 C-terminus에 존재하는 TMD가 protein의 올바른 localization을 위해 필요한지의 여부를 알아보기 위해 TMD deletion mutant를 protoplasts에 transformation 시킨 결과, WT과는 다르게 cytosol에 전반적으로 staining 되는 것을 알 수 있었다. 이것으로 TMD는 OsVam3p의 올바른 localization을 위해 중요하다는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로 우리는 OsVam3p가 정확하게 어디에 존재하는지를 조사 하기 위해 marker protein을 이용하였다. 그 결과 prevacuolar compartment(PVC)에 localization 되는 것으로 알려져 있는 AtVti1a와 colocalization 됨을 알 수 있었고, vacuolar menbrane을 staining 하는 FM4-64와 함께 사용하여 이 부위에 분포함도 확인하였다. 이것으로 OsVam3p가 PVC와 vacuolar membrane에 모두 존재 한다는 것을 알수 있었다. 다음으로 OsVam3p가 vesicle transport에는 어떠한 영향을 미치는 지를 cargo protein을 이용하여 알아 보았다. Central vacuole로 targeting되는 marker인 AALP는 OsVam3p가 overexpression 되었을 때 정상적인 trafficking이 저해 되었으나, H^(+)-ATPase의 경우에는 Osvam3p의 overexpression에 의해 저해 받지 않고 정상적으로 plasma membrane에 targeting 되었다. 이로부터 OsVam3p가 vacuole로의 vesicle transport에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 OsVam3p의 기능을 좀더 자세히 알아보기 위해 yeast two-hybrid screening을 실시하여 OsVam3p와 interaction하는 protein인 Prenylated Rab Acceptor(PRA)와 motor protein인 kinesin을 분리하였다. 그리고 각각 OsPRA1 (Oryza sativa PRA1), OsKinesin (Oryza sativa Kinesin) 이라고 명명하였다. 그리고 yeast two-hybrid assay결과 OsPRA1는 full-length OsVam3p와 binding 하였고, transmembrane domain deleted mutant(OsVam3pTMD)와는 binding 하지 않았다. 반면 OsKinesin은 OsVam3p의 full-length OsVam3p뿐 아니라 transmembrane domain deleted mutant(OsVam3pTMD) 와 모두 binding하였다. 더 나아가 colocalization study를 통해 OsVam3p와 OsPRA1이 PVC에서 같은 위치에 존재함도 알 수 있었다. 이로써 OsPRA1은 OsVam3p의 binding partner임을 확인할 수 있었다.

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