미생물을 촉매로 이용한 생물 전환 공정은 최근 식품, 제약, 화학 산업에서 요구되는 고부가가치 신소재 생산에 널리 응용되고 있다. 하지만 미생물에 독성이 강한 소수성유기화합물의 생합성 공정의 경우 생물 촉매의 생산성은 아직 상업적 이용에 필요한 수준에 미치지 못하고 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해 Pseudomonas sp. VLB120 유래의 ...
미생물을 촉매로 이용한 생물 전환 공정은 최근 식품, 제약, 화학 산업에서 요구되는 고부가가치 신소재 생산에 널리 응용되고 있다. 하지만 미생물에 독성이 강한 소수성유기화합물의 생합성 공정의 경우 생물 촉매의 생산성은 아직 상업적 이용에 필요한 수준에 미치지 못하고 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해 Pseudomonas sp. VLB120 유래의 styrene monooxygenase 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 모델로 하여 미생물에 독성이 강한 소수성 유기화합물의 생합성시 생물 촉매의 활성에 영향을 주는 인자들을 조사하였다. 기질과 반응산물인 스티렌 (styrene)과 스티렌 옥사이드 (styrene oxide)의 미생물에 대한 독성을 완화시키기 위해 bis(2-ethylhexyl)phthalate (BEHP)와 수용액 배지로 구성된 two-liquid phase medium을 반응액으로 사용하였다. 본 연구에 의하면 스티렌의 스티렌 옥사이드로의 산화반응은 세포내에 생산된 산화효소의 역가에 의해 그리고 물질전달에 의해 제한받지 않았다. 재조합 대장균의 스티렌 옥사이드 생산 활성은 반응물의 독성과 탄소원의 이용성 (availability)에 의해 크게 영향을 받았다. 재조합 대장균의 스티렌 옥사이드 생산성을 극대화하기 위해 유가식 배양 공정을 응용하여 생물 전환 공정을 최적화 하였다; 재조합 대장균이 고농도 (약 20 g/L)로 성장하였을 때 스티렌 산화반응을 개시하였고 또한 생물 전환 중 탄소원 공급, 반응 pH, 용존 산소 농도 등을 최적화 하였다. 결과로서 스티렌 옥사이드의 생산성과 최종 농도가 400 U/L와 60 g/L까지 각각 증가하였다. 이는 기존의 산화효소에 의한 탄화수소의 산화 반응에 대한 연구 결과와 비교해서 약 2~3 배 정도 향상된 수준이다. 미생물 촉매를 이용한 스티렌 산화공정의 생산성을 증가시키기 위한 또 다른 방안으로 소수성 유기화합물에 내성이 강한 균주 (스티렌 옥사이드를 대사하지 못하는 Pseudomonas sp. VLB120 변이주)를 미생물 촉매로 이용하는 생물전환을 연구하였다. Pseudomonas sp. VLB120 변이주는 재조합 대장균에 비해 스티렌 옥사이드의 비생산 속도는 유사하였지만 반응산물의 독성에 대한 내성이 높았기 때문에 대사 활성이 오래 유지되어 배양액 부피 당 생산성이 25% 정도 높았다. 본 연구에서 보여 주었듯이 미생물에 독성이 강한 소수성 유기화합물의 생산성을 증가시키기 위해서는 생물 공정과 생물 촉매를 최적화해야 하고 또한 반응산물에 대해 내성이 강한 균주를 촉매로 개발하는 일이 필요하리라 사료된다.
미생물을 촉매로 이용한 생물 전환 공정은 최근 식품, 제약, 화학 산업에서 요구되는 고부가가치 신소재 생산에 널리 응용되고 있다. 하지만 미생물에 독성이 강한 소수성 유기화합물의 생합성 공정의 경우 생물 촉매의 생산성은 아직 상업적 이용에 필요한 수준에 미치지 못하고 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해 Pseudomonas sp. VLB120 유래의 styrene monooxygenase 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 모델로 하여 미생물에 독성이 강한 소수성 유기화합물의 생합성시 생물 촉매의 활성에 영향을 주는 인자들을 조사하였다. 기질과 반응산물인 스티렌 (styrene)과 스티렌 옥사이드 (styrene oxide)의 미생물에 대한 독성을 완화시키기 위해 bis(2-ethylhexyl)phthalate (BEHP)와 수용액 배지로 구성된 two-liquid phase medium을 반응액으로 사용하였다. 본 연구에 의하면 스티렌의 스티렌 옥사이드로의 산화반응은 세포내에 생산된 산화효소의 역가에 의해 그리고 물질전달에 의해 제한받지 않았다. 재조합 대장균의 스티렌 옥사이드 생산 활성은 반응물의 독성과 탄소원의 이용성 (availability)에 의해 크게 영향을 받았다. 재조합 대장균의 스티렌 옥사이드 생산성을 극대화하기 위해 유가식 배양 공정을 응용하여 생물 전환 공정을 최적화 하였다; 재조합 대장균이 고농도 (약 20 g/L)로 성장하였을 때 스티렌 산화반응을 개시하였고 또한 생물 전환 중 탄소원 공급, 반응 pH, 용존 산소 농도 등을 최적화 하였다. 결과로서 스티렌 옥사이드의 생산성과 최종 농도가 400 U/L와 60 g/L까지 각각 증가하였다. 이는 기존의 산화효소에 의한 탄화수소의 산화 반응에 대한 연구 결과와 비교해서 약 2~3 배 정도 향상된 수준이다. 미생물 촉매를 이용한 스티렌 산화공정의 생산성을 증가시키기 위한 또 다른 방안으로 소수성 유기화합물에 내성이 강한 균주 (스티렌 옥사이드를 대사하지 못하는 Pseudomonas sp. VLB120 변이주)를 미생물 촉매로 이용하는 생물전환을 연구하였다. Pseudomonas sp. VLB120 변이주는 재조합 대장균에 비해 스티렌 옥사이드의 비생산 속도는 유사하였지만 반응산물의 독성에 대한 내성이 높았기 때문에 대사 활성이 오래 유지되어 배양액 부피 당 생산성이 25% 정도 높았다. 본 연구에서 보여 주었듯이 미생물에 독성이 강한 소수성 유기화합물의 생산성을 증가시키기 위해서는 생물 공정과 생물 촉매를 최적화해야 하고 또한 반응산물에 대해 내성이 강한 균주를 촉매로 개발하는 일이 필요하리라 사료된다.
Die Erforschung von Ganzzellbiokatalysatoren für enzymatische Oxygenierungen führte zur stetigen Steigerung ihrer katalytischen Effizienz. Die Umsatzraten sind jedoch häufig instabil. In lange andauernden Biotransformationen sind diese oft tiefer als in Aktivitätsassays mit kurzer Laufzeit. In der v...
Die Erforschung von Ganzzellbiokatalysatoren für enzymatische Oxygenierungen führte zur stetigen Steigerung ihrer katalytischen Effizienz. Die Umsatzraten sind jedoch häufig instabil. In lange andauernden Biotransformationen sind diese oft tiefer als in Aktivitätsassays mit kurzer Laufzeit. In der vorliegenden Forschungsarbeit befassten wir uns mit Escherichia coli JM101 (pSPZ10) als rekombinantem Ganzzellkatalysator, der die Styrolmonooxygenasegene styAB aus Pseudomonas sp. VLB120 exprimiert. Wir untersuchten Faktoren, die die biokatalytische Epoxidierung von Styrol zu (S)-Styroloxid in einem Zweiphasensystem mit Bis(2-ethylhexyl)phthalsäure (BEHP) als organischer Phase beeinflussen. Die Enzymaktivität und der Styrol- und Sauerstofftransport zu den Zellen waren im verwendeten System nicht limitierend. Die Produkttoxizität und die Verfügbarkeit der für die Kofaktorregeneration benötigten Kohlenstoffquelle beeinflussten hingegen die katalytische Effizienz. Ein auf Fed-Batch Kultivierung beruhender Prozess wurde genauer charakterisiert. Die Optimierung der Biokatalysatorkonzentration, des pHs, der Gelöstsauerstoffkonzentration sowie der Zusammensetzung und Zufuhrrate der Nährlösung erlaubte durchschnittliche und maximale Produktivitäten um 800U/L_(aq) (400U/L_(tot)) beziehungsweise 1800U/L_(aq) (900U/L_(tot)). Dabei wurden in der organischen Phase Produktkonzentrationen über 500mM (60g/L_(org)) erreicht. Der Anteil der Reduktionsequivalente, die von der Kohlenstoffquelle in die Styroloxygenierung fliessen, konnte von 10.4 auf 13.8% erhöht werden. Ein Ansatz zur weiteren Optimierung ist der Einsatz von lösungsmittelresistenten Stämmen. In diesem Sinne haben wir die „knock-out“ Mutante Pseudomonas sp. VLB120∆C untersucht. Sowohl in Aktivitätsassays (97U/g dry cells) wie auch in kontinuierlichen Kulturen (54U/g dry cells) wurden dabei hohe Umsatzraten gefunden. Interessanterweise verbrauchte die Pseudomonas-Mutante während der Biotransformation im Zwei-Phasen-System weniger Energie für den Lenbenserhaltungsstoffwechsel als Escherichia coli JM101 (pSPZ10). Daraus resultierte unter identischen Bedingungen eine um 25% höhere volumetrische Produktivität. Produkttoxizität ist, wie in der hier beschriebenen Styrolepoxidierung, oft eine Hauptlimitation in auf Ganzzellbiokatalysatoren beruhenden Oxygenierungsprozessen. Dieser kann sowohl mittels Prozessoptimierung als auch mittels Biokatalysatoroptimierung begegnet werden, wobei die Erhöhung der Lösungsmittelresistenz auch die Energieeffizienz verbessern kann. Diese Arbeit trägt zur Entwicklung und Anwendung von Mikroorganismen als leistungsfähige Katalysatoren in der industriellen organischen Synthese bei.
Die Erforschung von Ganzzellbiokatalysatoren für enzymatische Oxygenierungen führte zur stetigen Steigerung ihrer katalytischen Effizienz. Die Umsatzraten sind jedoch häufig instabil. In lange andauernden Biotransformationen sind diese oft tiefer als in Aktivitätsassays mit kurzer Laufzeit. In der vorliegenden Forschungsarbeit befassten wir uns mit Escherichia coli JM101 (pSPZ10) als rekombinantem Ganzzellkatalysator, der die Styrolmonooxygenasegene styAB aus Pseudomonas sp. VLB120 exprimiert. Wir untersuchten Faktoren, die die biokatalytische Epoxidierung von Styrol zu (S)-Styroloxid in einem Zweiphasensystem mit Bis(2-ethylhexyl)phthalsäure (BEHP) als organischer Phase beeinflussen. Die Enzymaktivität und der Styrol- und Sauerstofftransport zu den Zellen waren im verwendeten System nicht limitierend. Die Produkttoxizität und die Verfügbarkeit der für die Kofaktorregeneration benötigten Kohlenstoffquelle beeinflussten hingegen die katalytische Effizienz. Ein auf Fed-Batch Kultivierung beruhender Prozess wurde genauer charakterisiert. Die Optimierung der Biokatalysatorkonzentration, des pHs, der Gelöstsauerstoffkonzentration sowie der Zusammensetzung und Zufuhrrate der Nährlösung erlaubte durchschnittliche und maximale Produktivitäten um 800U/L_(aq) (400U/L_(tot)) beziehungsweise 1800U/L_(aq) (900U/L_(tot)). Dabei wurden in der organischen Phase Produktkonzentrationen über 500mM (60g/L_(org)) erreicht. Der Anteil der Reduktionsequivalente, die von der Kohlenstoffquelle in die Styroloxygenierung fliessen, konnte von 10.4 auf 13.8% erhöht werden. Ein Ansatz zur weiteren Optimierung ist der Einsatz von lösungsmittelresistenten Stämmen. In diesem Sinne haben wir die „knock-out“ Mutante Pseudomonas sp. VLB120∆C untersucht. Sowohl in Aktivitätsassays (97U/g dry cells) wie auch in kontinuierlichen Kulturen (54U/g dry cells) wurden dabei hohe Umsatzraten gefunden. Interessanterweise verbrauchte die Pseudomonas-Mutante während der Biotransformation im Zwei-Phasen-System weniger Energie für den Lenbenserhaltungsstoffwechsel als Escherichia coli JM101 (pSPZ10). Daraus resultierte unter identischen Bedingungen eine um 25% höhere volumetrische Produktivität. Produkttoxizität ist, wie in der hier beschriebenen Styrolepoxidierung, oft eine Hauptlimitation in auf Ganzzellbiokatalysatoren beruhenden Oxygenierungsprozessen. Dieser kann sowohl mittels Prozessoptimierung als auch mittels Biokatalysatoroptimierung begegnet werden, wobei die Erhöhung der Lösungsmittelresistenz auch die Energieeffizienz verbessern kann. Diese Arbeit trägt zur Entwicklung und Anwendung von Mikroorganismen als leistungsfähige Katalysatoren in der industriellen organischen Synthese bei.
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