In Antirrhinum majus (Löwenmäulchen) wird die Entwicklung der Petalen und Stamen, der Blütenorgane des zweiten und dritten Wirtels, von den homöotischen Genen DEFICIENS (DEF) und GLOBOSA (GLO) gesteuert. Die von den beiden Genen kodierten Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die zu der MADS-Box Fam...
In Antirrhinum majus (Löwenmäulchen) wird die Entwicklung der Petalen und Stamen, der Blütenorgane des zweiten und dritten Wirtels, von den homöotischen Genen DEFICIENS (DEF) und GLOBOSA (GLO) gesteuert. Die von den beiden Genen kodierten Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die zu der MADS-Box Familie gehören und die als Heterodimere die Organogenese von Petalen und Stamen kontrollieren. Nach dem genetischen ABC-Modell der Blütenentwicklung etablieren die beiden Gene die B-Funktion, die im Zusammenwirken mit der A- und der C-Funktion die Entwicklung der floralen Organe im zweiten beziehungsweise dritten Wirtel steuern. Die Expression der beiden B-Funktionsgene ist zeitlich und räumlich veränderlich. In frühen Stadien sind DEF und GLO in den Primordien exprimiert, aus denen sich später die Organe des zweiten und des dritten Blütenkreises - Petale und Stamen - entwickeln. In späteren Entwicklungsstadien der Blüte sind beide auch im Karpel des vierten Wirtels - wenn auch schwächer als in den Organen zweiten und dritten - exprimiert, und DEF auch schwach in den Sepalen des ersten Wirtels (Schwarz-Sommer et al, 1992;Tröbner et al,1992; Zachgo et al, 1995). Die Analyse der Expressionsmuster in DEF- und GLO-Mutanten ergab, daß beide Gene unabhängig von einander angeschaltet werden und danach organ- und gewebespezifisch streng reguliert werden (Tröbner et al, 1992). Über die molekularen Mechanismen dieser Regulation ist bislang wenig bekannt. Ein erster Schritt zum besseren Verständnis der molekularen Kontrollmechanismen war die Isolierung von ROSINA (RSI), eines möglichen Regulators von DEFICIENS, mittels des One-hybrid Systems in Hefe (M. Roccaro, pers. Mitteilung). RSI wurde isoliert mit einem 200 Bp langen Promotorfragment des DEF-Gens, das mehrere potentielle Bindemotive für Transkriptionsfaktoren wie z.B. bZIP- und MADS-Box Proteine enthält. Außerdem führt eine Deletion von drei Basenpaaren in dieser Region in dem Mutantenallel deficiens-chlorantha (def-chl) zu einer starken Reduktion der Expression im zweiten und dritten Wirtel, die phänotypisch als partielle homöotische Änderungen der Petalen und Stamen sichtbar wird. RSI ist ein Mitglied der b-ZIP-Familie von Transkriptionsfaktoren, das neben der basischen Region und dem Leucin-Zipper noch andere Domänen mit unbekannter Funktion enthält (M. Roccaro, pers. Mitteilung). Da solche Faktoren für die Ausübung ihrer regulatorischen Funktion meistens Partner benötigen, mit denen sie dimere oder multimere Proteinkomplexe bilden, wurde RSI in einem Hefe-Two-hybrid System als "Bait" benutzt, um potentiellen Interaktoren zu isolieren. Mit dieser Strategie wurden eine Reihe (sieben) von interagierenden Kandidaten isoliert, die zunächst durch verschiedene Kontrollexperimente in Hefe bestätigt und deren DNA-Sequenz dann ermittelt wurde. Eine Suche in verschiedenen Datenbanken zeigte in einigen Fällen Homologie der RSI-Interaktoren zu bereits bekannten Proteinen wie Ser/Thr-Kinasen oder Transkriptionsfaktoren von Pflanzen (Arabidopsis) und Tieren, aber teilweise auch zu Proteinen mit unbekannten Funktionen. Der interessanteste Kandidat war 2Y16 (später umbenannt zu "AmGRAS"), der starke Ähnlichkeit zu Mitgliedern (RGA und GAI) der GRASFamilie von Arabidopsis zeigte und der daher für eine tiefergehende funktionelle Analyse ausgewählt wurde. Die Protein-Interaktion mit RSI wurde biochemisch durch "GSTpulldown"-Experimente bestätigt. Expressionsanalysen mit RT-PCR und in situ Hybridisierung zeigten große Ähnlichkeiten zwischen AmGRAS und RGA und GAI von Arabidopsis, von denen vermutet wird, daß sie Transkriptionsfaktoren sind, die in der Gibberellin-Signal-Transduktion involviert sind. Zur weiteren funktionellen Charakterisierung von AmGRAS wurde die "Engrailed-Methode" (W. Werr, pers. Mitteilung) benutzt, um mit AmGRAS "Knockout"-Mutanten in Arabidopsis zu erzeugen, deren Analyse allerdings noch nicht beendet ist. Die bisherigen Ergebnisse und Daten legen die Vermutung nahe, daß AmGRAS das Antirrhinum-Ortholog einer der beiden Arabidopsis-Gene - RGA oder GAI - ist. Da bekannt ist, daß Gibberelline (GA) eine wichtige Rolle spielen in der Entwicklung der Blütenorgane, könnte die Interaktion von RSI und AmGRAS einen der Verbindungspunkte von GASignaltransduktion und der Expression/Regulation des floralen B-Funktionsgens DEFICIENS darstellen.
In Antirrhinum majus (Löwenmäulchen) wird die Entwicklung der Petalen und Stamen, der Blütenorgane des zweiten und dritten Wirtels, von den homöotischen Genen DEFICIENS (DEF) und GLOBOSA (GLO) gesteuert. Die von den beiden Genen kodierten Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die zu der MADS-Box Familie gehören und die als Heterodimere die Organogenese von Petalen und Stamen kontrollieren. Nach dem genetischen ABC-Modell der Blütenentwicklung etablieren die beiden Gene die B-Funktion, die im Zusammenwirken mit der A- und der C-Funktion die Entwicklung der floralen Organe im zweiten beziehungsweise dritten Wirtel steuern. Die Expression der beiden B-Funktionsgene ist zeitlich und räumlich veränderlich. In frühen Stadien sind DEF und GLO in den Primordien exprimiert, aus denen sich später die Organe des zweiten und des dritten Blütenkreises - Petale und Stamen - entwickeln. In späteren Entwicklungsstadien der Blüte sind beide auch im Karpel des vierten Wirtels - wenn auch schwächer als in den Organen zweiten und dritten - exprimiert, und DEF auch schwach in den Sepalen des ersten Wirtels (Schwarz-Sommer et al, 1992;Tröbner et al,1992; Zachgo et al, 1995). Die Analyse der Expressionsmuster in DEF- und GLO-Mutanten ergab, daß beide Gene unabhängig von einander angeschaltet werden und danach organ- und gewebespezifisch streng reguliert werden (Tröbner et al, 1992). Über die molekularen Mechanismen dieser Regulation ist bislang wenig bekannt. Ein erster Schritt zum besseren Verständnis der molekularen Kontrollmechanismen war die Isolierung von ROSINA (RSI), eines möglichen Regulators von DEFICIENS, mittels des One-hybrid Systems in Hefe (M. Roccaro, pers. Mitteilung). RSI wurde isoliert mit einem 200 Bp langen Promotorfragment des DEF-Gens, das mehrere potentielle Bindemotive für Transkriptionsfaktoren wie z.B. bZIP- und MADS-Box Proteine enthält. Außerdem führt eine Deletion von drei Basenpaaren in dieser Region in dem Mutantenallel deficiens-chlorantha (def-chl) zu einer starken Reduktion der Expression im zweiten und dritten Wirtel, die phänotypisch als partielle homöotische Änderungen der Petalen und Stamen sichtbar wird. RSI ist ein Mitglied der b-ZIP-Familie von Transkriptionsfaktoren, das neben der basischen Region und dem Leucin-Zipper noch andere Domänen mit unbekannter Funktion enthält (M. Roccaro, pers. Mitteilung). Da solche Faktoren für die Ausübung ihrer regulatorischen Funktion meistens Partner benötigen, mit denen sie dimere oder multimere Proteinkomplexe bilden, wurde RSI in einem Hefe-Two-hybrid System als "Bait" benutzt, um potentiellen Interaktoren zu isolieren. Mit dieser Strategie wurden eine Reihe (sieben) von interagierenden Kandidaten isoliert, die zunächst durch verschiedene Kontrollexperimente in Hefe bestätigt und deren DNA-Sequenz dann ermittelt wurde. Eine Suche in verschiedenen Datenbanken zeigte in einigen Fällen Homologie der RSI-Interaktoren zu bereits bekannten Proteinen wie Ser/Thr-Kinasen oder Transkriptionsfaktoren von Pflanzen (Arabidopsis) und Tieren, aber teilweise auch zu Proteinen mit unbekannten Funktionen. Der interessanteste Kandidat war 2Y16 (später umbenannt zu "AmGRAS"), der starke Ähnlichkeit zu Mitgliedern (RGA und GAI) der GRASFamilie von Arabidopsis zeigte und der daher für eine tiefergehende funktionelle Analyse ausgewählt wurde. Die Protein-Interaktion mit RSI wurde biochemisch durch "GSTpulldown"-Experimente bestätigt. Expressionsanalysen mit RT-PCR und in situ Hybridisierung zeigten große Ähnlichkeiten zwischen AmGRAS und RGA und GAI von Arabidopsis, von denen vermutet wird, daß sie Transkriptionsfaktoren sind, die in der Gibberellin-Signal-Transduktion involviert sind. Zur weiteren funktionellen Charakterisierung von AmGRAS wurde die "Engrailed-Methode" (W. Werr, pers. Mitteilung) benutzt, um mit AmGRAS "Knockout"-Mutanten in Arabidopsis zu erzeugen, deren Analyse allerdings noch nicht beendet ist. Die bisherigen Ergebnisse und Daten legen die Vermutung nahe, daß AmGRAS das Antirrhinum-Ortholog einer der beiden Arabidopsis-Gene - RGA oder GAI - ist. Da bekannt ist, daß Gibberelline (GA) eine wichtige Rolle spielen in der Entwicklung der Blütenorgane, könnte die Interaktion von RSI und AmGRAS einen der Verbindungspunkte von GASignaltransduktion und der Expression/Regulation des floralen B-Funktionsgens DEFICIENS darstellen.
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#AmGRAS ROSINA DEFICIENS
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