고순도 agarose 생산을 위한 탈황 효소의 대량 생산 및 탈황 반응의 최적화 Overproduction of Desulfatation Enzymes for Preparation of High-Purity Agarose and Optimization of Desulfatation Reaction원문보기
Pyrococcus horikoshii OT3는 최적 생장 온도가 98℃이다. Genome sequence 정보로부터 sulfatase라고 추정되는 ORF (open reading frame) 부분을 PCR 증폭 (921 bp)하여 대장균 vector (pET21a vector) cloning 하여 대장균 BL21(DE3)와 Rosetta(DE3)에 형질 전환하여 발현 시키고 분자량은 35 kDa 이라고 추정되고, 50 μM IPTG 유도 시 유도시간 2.5 시간일 때 4.16 Unit/ml로서 가장 높은 활성을 나타내었다. 발현된 재조합 효소의 최적 pH는 7.0으로 나타났다. 최근, 새로운 ...
Pyrococcus horikoshii OT3는 최적 생장 온도가 98℃이다. Genome sequence 정보로부터 sulfatase라고 추정되는 ORF (open reading frame) 부분을 PCR 증폭 (921 bp)하여 대장균 vector (pET21a vector) cloning 하여 대장균 BL21(DE3)와 Rosetta(DE3)에 형질 전환하여 발현 시키고 분자량은 35 kDa 이라고 추정되고, 50 μM IPTG 유도 시 유도시간 2.5 시간일 때 4.16 Unit/ml로서 가장 높은 활성을 나타내었다. 발현된 재조합 효소의 최적 pH는 7.0으로 나타났다. 최근, 새로운 E. coli 발현 시스템인 pHCE vector 계열로서, Geobacillus toebii의 D-amino acid aminotransferase (D-AAT) gene의 upstream 유래의 HCE promoter를 사용하여 구성적으로 외래 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 해양성 유래인 Pseudoalteromonas carrageenovora의 arylsulfatase 유전자의 구성적 발현계를 구축하기 위해 arylsulfatase DNA fragment를 pHCE-IA에 subcloning 하였다. E. coli BL21(DE3)/ pHCE-AST로부터 최적 arylsulfatase 생산을 위해 다양한 배지에서 배양하였다. Arylsulfatase의 과발현을 위해 재조합 대장균의 성장이 catabolite repression에 영향을 받지 않고, LB 배지보다 대장균 성장은 약 3~4 배, 단백질의 발현양은 2~3 배 증가 시킬 수 있는 Maxybroth 배지와 함께 glycerol을 첨가한 다양한 배지 조성으로 유가배양을 행하였고, 그 결과 Maxy broth HD 배지에 2% glycerol이 첨가된 배지에서 회분배양에서 보다 2~5배 정도 증가된 arylsulfatase 활성을 나타내었다. Agaropectin에 arylsulfatase를 반응시켜 황 제거를 통해 agarose로 바꾸는 공정을 간단하고 높은 수율을 얻을 수 있을 뿐 아니라 agarose 생산에 적용할 수 있었다. Agarose 경우 처리되는 효소량이 많을수록 황 함량이 줄어들고 10 Unit/ml 효소량을 처리하였을 때 0.25% 이하로 황 함량이 줄어든 것으로 나타났다. 탈황의 최적 조건으로는 pH 6.0, 40℃, 3 시간 반응으로 나타났다. 1% DNA 전기영동 agarose gel의 강도는 효소적 처리에 의해 제조된 agarose 경우 최대 800±0.17 (g/㎠)로 상업적 agarose의 강도 수치와 비슷한 결과로 나타났다.
Pyrococcus horikoshii OT3는 최적 생장 온도가 98℃이다. Genome sequence 정보로부터 sulfatase라고 추정되는 ORF (open reading frame) 부분을 PCR 증폭 (921 bp)하여 대장균 vector (pET21a vector) cloning 하여 대장균 BL21(DE3)와 Rosetta(DE3)에 형질 전환하여 발현 시키고 분자량은 35 kDa 이라고 추정되고, 50 μM IPTG 유도 시 유도시간 2.5 시간일 때 4.16 Unit/ml로서 가장 높은 활성을 나타내었다. 발현된 재조합 효소의 최적 pH는 7.0으로 나타났다. 최근, 새로운 E. coli 발현 시스템인 pHCE vector 계열로서, Geobacillus toebii의 D-amino acid aminotransferase (D-AAT) gene의 upstream 유래의 HCE promoter를 사용하여 구성적으로 외래 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 해양성 유래인 Pseudoalteromonas carrageenovora의 arylsulfatase 유전자의 구성적 발현계를 구축하기 위해 arylsulfatase DNA fragment를 pHCE-IA에 subcloning 하였다. E. coli BL21(DE3)/ pHCE-AST로부터 최적 arylsulfatase 생산을 위해 다양한 배지에서 배양하였다. Arylsulfatase의 과발현을 위해 재조합 대장균의 성장이 catabolite repression에 영향을 받지 않고, LB 배지보다 대장균 성장은 약 3~4 배, 단백질의 발현양은 2~3 배 증가 시킬 수 있는 Maxybroth 배지와 함께 glycerol을 첨가한 다양한 배지 조성으로 유가배양을 행하였고, 그 결과 Maxy broth HD 배지에 2% glycerol이 첨가된 배지에서 회분배양에서 보다 2~5배 정도 증가된 arylsulfatase 활성을 나타내었다. Agaropectin에 arylsulfatase를 반응시켜 황 제거를 통해 agarose로 바꾸는 공정을 간단하고 높은 수율을 얻을 수 있을 뿐 아니라 agarose 생산에 적용할 수 있었다. Agarose 경우 처리되는 효소량이 많을수록 황 함량이 줄어들고 10 Unit/ml 효소량을 처리하였을 때 0.25% 이하로 황 함량이 줄어든 것으로 나타났다. 탈황의 최적 조건으로는 pH 6.0, 40℃, 3 시간 반응으로 나타났다. 1% DNA 전기영동 agarose gel의 강도는 효소적 처리에 의해 제조된 agarose 경우 최대 800±0.17 (g/㎠)로 상업적 agarose의 강도 수치와 비슷한 결과로 나타났다.
The sulfatase gene (sft) of Pyrococcus horikoshii OT3 was cloned from the genomic DNA and subcloned into the pET21a vector, resulting the sulfatase expression plasmid, pPH-ST (6.3 kb). When E. coli BL21(DE3)/pPH-ST was cultured on LB medium, the sulfatase activity reached about 4.16 Unit/ml at 8 hr ...
The sulfatase gene (sft) of Pyrococcus horikoshii OT3 was cloned from the genomic DNA and subcloned into the pET21a vector, resulting the sulfatase expression plasmid, pPH-ST (6.3 kb). When E. coli BL21(DE3)/pPH-ST was cultured on LB medium, the sulfatase activity reached about 4.16 Unit/ml at 8 hr after addition of 50 μM IPTG. The optimized condition for the overexpression of sulfatase in E. coli was follows : 50 μM IPTG, 8 hr induction time, IPTG addition at OD_(660) = 2.5. The molecular weight of the recombinant sulfatase was estimated to be 35 kDa by SDS-PAGE. The optimized reaction condition is determined as follows : pH 7.0, 0.5 M Tris-HCl buffer. Recently, a new E. coli expression system, the pHCE vector series, using a constitutively expressing HCE promoter derived upstream from the D-amino acid aminotransferase (D-AAT) gene of Geobacillus toebii, was developed for the high level expression of foreign proteins without induction. Arylsulfatase constitutive expression plasmid, pHCE-AST, was constructed with arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from P. carrageenovora genome subcloned into the pHCE-IA vector. E. coli BL21(DE3)/pHCE-AST was cultured in Maxybroth-FC medium arylsulfatase activity reached about 7.08 Unit/ml after 16 h culture. In the fermentor batch culture of E. coli cell on LB medium containig 2% glycerol, the activity of the enzymes reached about 16.0 Unit/ml, with Maxybroth-HD medium containing 2% glycerol, E. coli cell showed 2-fold higher expression level of arylsulfatase, ca. 30.0 Unit/ml. The fed-bach cultivation employing the additional feeding of glycerol gave 2-5 fold higher levels of cell growth and enzyme activity. The resolution of agarose prepared from agar by this enzyme was compared with a commercially available agarose by running DNA ladders. The result suggests that arylsulfatase overexpressed in E. coli could be applicable to the economic production of electrophoretic-grade agarose.
The sulfatase gene (sft) of Pyrococcus horikoshii OT3 was cloned from the genomic DNA and subcloned into the pET21a vector, resulting the sulfatase expression plasmid, pPH-ST (6.3 kb). When E. coli BL21(DE3)/pPH-ST was cultured on LB medium, the sulfatase activity reached about 4.16 Unit/ml at 8 hr after addition of 50 μM IPTG. The optimized condition for the overexpression of sulfatase in E. coli was follows : 50 μM IPTG, 8 hr induction time, IPTG addition at OD_(660) = 2.5. The molecular weight of the recombinant sulfatase was estimated to be 35 kDa by SDS-PAGE. The optimized reaction condition is determined as follows : pH 7.0, 0.5 M Tris-HCl buffer. Recently, a new E. coli expression system, the pHCE vector series, using a constitutively expressing HCE promoter derived upstream from the D-amino acid aminotransferase (D-AAT) gene of Geobacillus toebii, was developed for the high level expression of foreign proteins without induction. Arylsulfatase constitutive expression plasmid, pHCE-AST, was constructed with arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from P. carrageenovora genome subcloned into the pHCE-IA vector. E. coli BL21(DE3)/pHCE-AST was cultured in Maxybroth-FC medium arylsulfatase activity reached about 7.08 Unit/ml after 16 h culture. In the fermentor batch culture of E. coli cell on LB medium containig 2% glycerol, the activity of the enzymes reached about 16.0 Unit/ml, with Maxybroth-HD medium containing 2% glycerol, E. coli cell showed 2-fold higher expression level of arylsulfatase, ca. 30.0 Unit/ml. The fed-bach cultivation employing the additional feeding of glycerol gave 2-5 fold higher levels of cell growth and enzyme activity. The resolution of agarose prepared from agar by this enzyme was compared with a commercially available agarose by running DNA ladders. The result suggests that arylsulfatase overexpressed in E. coli could be applicable to the economic production of electrophoretic-grade agarose.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.