Ofloxacin(OFX)은 1차 항결핵제에 내성을 보이는 다제내성 결핵의 치료를 위해 사용되는 중요한 2차 항결핵제이다. OFX에 대한 내성 결핵균이 증가하고 있는 요즘 다제내성 결핵환자의 적절한 치료를 위해 빠르고 정확한 OFX 감수성 검사법의 개발은 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 2차 항결핵제인 OFX 내성과 관련된 gyrA 유전자변이를 분석함으로써 약제에 대한 내성기전을 이해하고 이와 같은 분자생물학적 정보를 이용하여 결핵균의 OFX에 대한 내성여부를 신속하게 진단할 수 있는 검사법 개발을 본 연구의 최종 목표로 하였다. OFX의 주요 target은 topoisomerase type Ⅱ라고도 불리는 DNA gyrase로 알려져 있다. OFX에 내성을 보이는 결핵균은 DNA gyrase를 암호화하는 유전자 중 gyrA 유전자의 quinolone resistance determining region(QRDR)에 돌연변이가 존재하는 것으로 알려져 있으며 QRDR은 결핵균의 OFX이 DNA gyrase와 상호 작용하는 부위인 것으로 알려져 있다. 국립마산 결핵병원에서 분양받은 OFX 내성 43 균주와 감수성 50 균주의 gyrA의 QRDR ...
Ofloxacin(OFX)은 1차 항결핵제에 내성을 보이는 다제내성 결핵의 치료를 위해 사용되는 중요한 2차 항결핵제이다. OFX에 대한 내성 결핵균이 증가하고 있는 요즘 다제내성 결핵환자의 적절한 치료를 위해 빠르고 정확한 OFX 감수성 검사법의 개발은 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 2차 항결핵제인 OFX 내성과 관련된 gyrA 유전자변이를 분석함으로써 약제에 대한 내성기전을 이해하고 이와 같은 분자생물학적 정보를 이용하여 결핵균의 OFX에 대한 내성여부를 신속하게 진단할 수 있는 검사법 개발을 본 연구의 최종 목표로 하였다. OFX의 주요 target은 topoisomerase type Ⅱ라고도 불리는 DNA gyrase로 알려져 있다. OFX에 내성을 보이는 결핵균은 DNA gyrase를 암호화하는 유전자 중 gyrA 유전자의 quinolone resistance determining region(QRDR)에 돌연변이가 존재하는 것으로 알려져 있으며 QRDR은 결핵균의 OFX이 DNA gyrase와 상호 작용하는 부위인 것으로 알려져 있다. 국립마산 결핵병원에서 분양받은 OFX 내성 43 균주와 감수성 50 균주의 gyrA의 QRDR 염기서열을 분석한 결과, codon 88에서는 2종류의 돌연변이가, 90과 91부위에서는 각각 1종류의 돌연변이가, 94에서는 5종류의 돌연변이가 발견되었다. 한편 codon 95 부위에 존재하는 돌연변이는 감수성균ㆍ내성균에 관계없이 존재하는 polymorphism부위였다. 염기 서열 분석 결과를 바탕으로 감수성 균주에만 결합하는 21 bp의 wild type probe를 고안하였다. 이어 고안한 wild type probe의 유용성을 확인하기 위해 57주의 임상분리 결핵균주로 dot blot hybridization을 실시하였다. dot blot hybridization 결과를 57 균주의 gyrA 유전자 염기서열 분석 결과와 비교한 결과 96.5%가 일치하였고 결과가 일치하지 않은 균주의 염기서열을 확인한 결과 감수성 균주와 내성 균주가 섞여 있는 것을 알 수 있었다. 이러한 경우에 위음성의 위험성이 있으므로 감수성 probe뿐만이 아니라 내성 probe도 필요하게 되었다. 따라서 다양한 mutation probe를 제작하였고, 이렇게 제작된 다수의 probe를 이용하여 reverse blot hybridization assay(REBA)를 57주의 임상분리 결핵균주를 대상으로 실험하였다. 그 결과, 염기서열분석 결과와 100% 일치하였다. 따라서, 결핵균의 OFX 내성과 관련된 gyrA QRDR내의 돌연변이를 검출할 수 있는 유용한 분자생물학적 검사법을 확립하였다. 추후 국립마산 결핵병원으로부터 135 균주를 더 분양받아 REBA의 유용성을 확인하였다. 본 연구에서 REBA를 수행한 총 285 균주 중 169 균주가 전통적인 감수성 검사법에 의해 OFX 내성이었고, 내성균주 중 85 균주만이 gyrA 유전자에 돌연변이가 있어 이러한 균주들은 모두 본 연구결과로 제작된 REBA법으로 검출할 수 있었다. 따라서 REBA의 민감도는 50%이었다. 그러나 좀 더 민감도가 뛰어난 분자생물학적인 OFX 감수성 검사법 개발을 위해서는 OFX 내성과 관련된 유전자에 대한 연구와 유용한 내성 marker를 찾기 위한 연구가 좀 더 진행되어야 할 것으로 생각된다.Ofloxacin has anti-mycobacterial activity that possibly contributes a pivotal role in the second-line drug regimens that are used for the treatment of multidrug-resistant tuberculosis. However, in some communities, the resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to this agent is surging. Therefore, a rapid and accurate method that can be used to determine the resistance of M. tuberculosis to the ofloxacin can be very useful for effective treatment of the patients. This study was set up to develop such a method. From previous studies, it has been well known that ofloxacin resistance is associated with mutations in a gene encoding the gyrase A subunit protein. In this study, we were obtained 43 ofloxacin-resistant and 50 ofloxacin-susceptible M. tuberculosis clinical isolates from the Masan National TB Hospital, and sequences of DNA fragment of 320 bp, region of gyrA corresponding to the ofloxacin resistance-determining region were analyzed. In brief, the results showed that a total of seven mutation types were found at gyrA. Theses mutations were all clustered within nucleotides 2566 to 2586 of the gyrA gene(codons 88 to 94). Codon 94 was the most frequently substituted site. Twenty-four of the 43 isolates had mutations at this position resulting in a total of five different types of amino acid changes(Asp→Asn, Asp→Gly, Asp→Ala, Asp→Tyr, and Asp→His). Five isolates contained a mutation at codon 90 resulting Ala→Val change. Four isolates had mutations at codon 91 causing a Ser→Pro change at this site. Two isolates contained a mutation at codon 88 and they have result of different types of amino acid changes(Gly→Cys, Gly→Ala). On the other hand, polymorphic site at codon 95 was found in both ofloxacin-resistant and 50 ofloxacin-susceptible isolates. Subsequently, an oligonucleoti de probe for wild type sequence was designed and used to develop a dot blot hybridization assay system to determine ofloxacin resistance of M. tuberculosis. To evaluate this probe, dot-blot hybridization was carried out using other 57 clinical isolates. Dot blot hybridization results using the 57 clinical isolates were 96.5% concordant with results of sequencing. Wild type probes and mutation probes for reverse blot hybridization assay(REBA) were designed based on the probe of dot blot hybridization. REBA results of the 57 clinical isolates were 100% concordant with results of sequencing. Additional, 135 M. tuberculosis isolates were obtained from the Masan National TB Hospital and used for REBA. In summary a total of 285 M. tuberculosis clinical isolates that were obtained from Masan National TB Hospital were subjected for REBA. Among these isolates, 168 clinical isolates were ofloxacin-resistant and 86 isolates contained mutation at gyrA QRDR. Therefore, the sensitivity of the REBA developed in the study was 50%
Ofloxacin(OFX)은 1차 항결핵제에 내성을 보이는 다제내성 결핵의 치료를 위해 사용되는 중요한 2차 항결핵제이다. OFX에 대한 내성 결핵균이 증가하고 있는 요즘 다제내성 결핵환자의 적절한 치료를 위해 빠르고 정확한 OFX 감수성 검사법의 개발은 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 2차 항결핵제인 OFX 내성과 관련된 gyrA 유전자변이를 분석함으로써 약제에 대한 내성기전을 이해하고 이와 같은 분자생물학적 정보를 이용하여 결핵균의 OFX에 대한 내성여부를 신속하게 진단할 수 있는 검사법 개발을 본 연구의 최종 목표로 하였다. OFX의 주요 target은 topoisomerase type Ⅱ라고도 불리는 DNA gyrase로 알려져 있다. OFX에 내성을 보이는 결핵균은 DNA gyrase를 암호화하는 유전자 중 gyrA 유전자의 quinolone resistance determining region(QRDR)에 돌연변이가 존재하는 것으로 알려져 있으며 QRDR은 결핵균의 OFX이 DNA gyrase와 상호 작용하는 부위인 것으로 알려져 있다. 국립마산 결핵병원에서 분양받은 OFX 내성 43 균주와 감수성 50 균주의 gyrA의 QRDR 염기서열을 분석한 결과, codon 88에서는 2종류의 돌연변이가, 90과 91부위에서는 각각 1종류의 돌연변이가, 94에서는 5종류의 돌연변이가 발견되었다. 한편 codon 95 부위에 존재하는 돌연변이는 감수성균ㆍ내성균에 관계없이 존재하는 polymorphism부위였다. 염기 서열 분석 결과를 바탕으로 감수성 균주에만 결합하는 21 bp의 wild type probe를 고안하였다. 이어 고안한 wild type probe의 유용성을 확인하기 위해 57주의 임상분리 결핵균주로 dot blot hybridization을 실시하였다. dot blot hybridization 결과를 57 균주의 gyrA 유전자 염기서열 분석 결과와 비교한 결과 96.5%가 일치하였고 결과가 일치하지 않은 균주의 염기서열을 확인한 결과 감수성 균주와 내성 균주가 섞여 있는 것을 알 수 있었다. 이러한 경우에 위음성의 위험성이 있으므로 감수성 probe뿐만이 아니라 내성 probe도 필요하게 되었다. 따라서 다양한 mutation probe를 제작하였고, 이렇게 제작된 다수의 probe를 이용하여 reverse blot hybridization assay(REBA)를 57주의 임상분리 결핵균주를 대상으로 실험하였다. 그 결과, 염기서열분석 결과와 100% 일치하였다. 따라서, 결핵균의 OFX 내성과 관련된 gyrA QRDR내의 돌연변이를 검출할 수 있는 유용한 분자생물학적 검사법을 확립하였다. 추후 국립마산 결핵병원으로부터 135 균주를 더 분양받아 REBA의 유용성을 확인하였다. 본 연구에서 REBA를 수행한 총 285 균주 중 169 균주가 전통적인 감수성 검사법에 의해 OFX 내성이었고, 내성균주 중 85 균주만이 gyrA 유전자에 돌연변이가 있어 이러한 균주들은 모두 본 연구결과로 제작된 REBA법으로 검출할 수 있었다. 따라서 REBA의 민감도는 50%이었다. 그러나 좀 더 민감도가 뛰어난 분자생물학적인 OFX 감수성 검사법 개발을 위해서는 OFX 내성과 관련된 유전자에 대한 연구와 유용한 내성 marker를 찾기 위한 연구가 좀 더 진행되어야 할 것으로 생각된다.Ofloxacin has anti-mycobacterial activity that possibly contributes a pivotal role in the second-line drug regimens that are used for the treatment of multidrug-resistant tuberculosis. However, in some communities, the resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to this agent is surging. Therefore, a rapid and accurate method that can be used to determine the resistance of M. tuberculosis to the ofloxacin can be very useful for effective treatment of the patients. This study was set up to develop such a method. From previous studies, it has been well known that ofloxacin resistance is associated with mutations in a gene encoding the gyrase A subunit protein. In this study, we were obtained 43 ofloxacin-resistant and 50 ofloxacin-susceptible M. tuberculosis clinical isolates from the Masan National TB Hospital, and sequences of DNA fragment of 320 bp, region of gyrA corresponding to the ofloxacin resistance-determining region were analyzed. In brief, the results showed that a total of seven mutation types were found at gyrA. Theses mutations were all clustered within nucleotides 2566 to 2586 of the gyrA gene(codons 88 to 94). Codon 94 was the most frequently substituted site. Twenty-four of the 43 isolates had mutations at this position resulting in a total of five different types of amino acid changes(Asp→Asn, Asp→Gly, Asp→Ala, Asp→Tyr, and Asp→His). Five isolates contained a mutation at codon 90 resulting Ala→Val change. Four isolates had mutations at codon 91 causing a Ser→Pro change at this site. Two isolates contained a mutation at codon 88 and they have result of different types of amino acid changes(Gly→Cys, Gly→Ala). On the other hand, polymorphic site at codon 95 was found in both ofloxacin-resistant and 50 ofloxacin-susceptible isolates. Subsequently, an oligonucleoti de probe for wild type sequence was designed and used to develop a dot blot hybridization assay system to determine ofloxacin resistance of M. tuberculosis. To evaluate this probe, dot-blot hybridization was carried out using other 57 clinical isolates. Dot blot hybridization results using the 57 clinical isolates were 96.5% concordant with results of sequencing. Wild type probes and mutation probes for reverse blot hybridization assay(REBA) were designed based on the probe of dot blot hybridization. REBA results of the 57 clinical isolates were 100% concordant with results of sequencing. Additional, 135 M. tuberculosis isolates were obtained from the Masan National TB Hospital and used for REBA. In summary a total of 285 M. tuberculosis clinical isolates that were obtained from Masan National TB Hospital were subjected for REBA. Among these isolates, 168 clinical isolates were ofloxacin-resistant and 86 isolates contained mutation at gyrA QRDR. Therefore, the sensitivity of the REBA developed in the study was 50%
주제어
#gyrA 유전자 내성 mycobacterium tuberculosis ofloxacin resistance gyrA gene dot blot hybridization reverse blot hybridization(REBA)
학위논문 정보
저자
김준호
학위수여기관
연세대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
임상병리학과
지도교수
이혜영
발행연도
2006
총페이지
vi, 48장
키워드
gyrA 유전자 내성 mycobacterium tuberculosis ofloxacin resistance gyrA gene dot blot hybridization reverse blot hybridization(REBA)
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