유방암 세포에서 과발현되는 발암단백질인 PTK6의 결합단백질의 발굴 및 PTK6의 결합단백질로서 ARAP1의 분석 Screening of PTK6-interacting proteins and characterization of ARAP1 as a novel interacting protein of PTK6원문보기
이은샘
(Graduate School, Yonsei University
Dept. of Biochemistry
국내석사)
PTK6 (Brk Brk라고도 라고도 알려져 있음 있음)는 비수용체 tyrosine kinase 중의하나로 SH3 부위 부위, SH2 부위 부위, 그리고 tyrosine kinase kinase의 촉매 부위로 구성되어 있다 있다. PTK6 PTK6는 유방암과 같은 다양한 carcinomas carcinomas와정상적인 대장과 소장의 상피세포에서 높게 발현된다 발현된다. PTK6 PTK6의 기능을 이해하기 위한 시도로써 시도로써, Flag-PTK6 를 지속적으로 발현하는 HEK 293 세포주를 구축한 후 Flag-PTK6 PTK6를 Flag 항체가 붙은agarose agarose로 pull-down down하여 하여 PTK6 PTK6와 결합하는 단백질들을 분석하였다. Pull-down down에서 에서 얻은 단백질들을 를 ...
PTK6 (Brk Brk라고도 라고도 알려져 있음 있음)는 비수용체 tyrosine kinase 중의하나로 SH3 부위 부위, SH2 부위 부위, 그리고 tyrosine kinase kinase의 촉매 부위로 구성되어 있다 있다. PTK6 PTK6는 유방암과 같은 다양한 carcinomas carcinomas와정상적인 대장과 소장의 상피세포에서 높게 발현된다 발현된다. PTK6 PTK6의 기능을 이해하기 위한 시도로써 시도로써, Flag-PTK6 를 지속적으로 발현하는 HEK 293 세포주를 구축한 후 Flag-PTK6 PTK6를 Flag 항체가 붙은agarose agarose로 pull-down down하여 하여 PTK6 PTK6와 결합하는 단백질들을 분석하였다. Pull-down down에서 에서 얻은 단백질들을 를 trypsin trypsin을 이용한 in-geldigestion digestion과 MALDI-TOF MS 방법을 이용하여 분석한 결과ARAP1, Kinesin family member 11, Unnamed protein(accession number: BAB14088.1), Heat shock protein90-alpha, 그리고 Sam68 임이 밝혀졌고 밝혀졌고, PTK6 PTK6의 새로운 결합 단백질로서 164 kDa ARAP1 ARAP1을 선택하였다 선택하였다. PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1과의 과의 결합은 serum serum을 depletion depletion한 세포에서는 관찰되지 않았으며 않았으며, EGF자극에 의하여 증가하였다 증가하였다. 또한 또한, EGF 수용체의 인산화를 억제하는AG 1478 1478과 PTK 활성을 억제하는 Genistein 및 Src tyrosinekinase 억제제인 PP1 PP1에 의해 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1의 결합이 억제되는것을 확인하였다 확인하였다. PTK6 활성이 없는 돌연변이체를 사용하였을 때에는 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1이 약하게 결합하는 것으로 관찰되어 PTK6의 활성이 ARAP1 ARAP1과의 과의 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할수 있었다 있었다. 이들 결합에는 PTK6 PTK6의 SH2 부위가 필수적이었으며 필수적이었으며,SH2 부위 중에서도 인산화된 tyrosine tyrosine을 인식하는 R105 아미노산잔기가 관여함을 알 수 있었다 있었다. 그리고 그리고, PTK6 PTK6를 세포막 또는 핵속에 위치하도록 변형시켰을 때 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1의과 의과 결합이 감소하는 것으로 보아 보아, ARAP1 ARAP1은 세포질에 있는 PTK6 PTK6와 결합할 것으로 생각된다 생각된다. 이러한 결과로부터 PTK6 PTK6가 ARAP1 ARAP1과 결합함으로써세포 이동에 관여할 것으로 보인다 보인다.
PTK6 (Brk Brk라고도 라고도 알려져 있음 있음)는 비수용체 tyrosine kinase 중의하나로 SH3 부위 부위, SH2 부위 부위, 그리고 tyrosine kinase kinase의 촉매 부위로 구성되어 있다 있다. PTK6 PTK6는 유방암과 같은 다양한 carcinomas carcinomas와정상적인 대장과 소장의 상피세포에서 높게 발현된다 발현된다. PTK6 PTK6의 기능을 이해하기 위한 시도로써 시도로써, Flag-PTK6 를 지속적으로 발현하는 HEK 293 세포주를 구축한 후 Flag-PTK6 PTK6를 Flag 항체가 붙은agarose agarose로 pull-down down하여 하여 PTK6 PTK6와 결합하는 단백질들을 분석하였다. Pull-down down에서 에서 얻은 단백질들을 를 trypsin trypsin을 이용한 in-geldigestion digestion과 MALDI-TOF MS 방법을 이용하여 분석한 결과ARAP1, Kinesin family member 11, Unnamed protein(accession number: BAB14088.1), Heat shock protein90-alpha, 그리고 Sam68 임이 밝혀졌고 밝혀졌고, PTK6 PTK6의 새로운 결합 단백질로서 164 kDa ARAP1 ARAP1을 선택하였다 선택하였다. PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1과의 과의 결합은 serum serum을 depletion depletion한 세포에서는 관찰되지 않았으며 않았으며, EGF자극에 의하여 증가하였다 증가하였다. 또한 또한, EGF 수용체의 인산화를 억제하는AG 1478 1478과 PTK 활성을 억제하는 Genistein 및 Src tyrosinekinase 억제제인 PP1 PP1에 의해 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1의 결합이 억제되는것을 확인하였다 확인하였다. PTK6 활성이 없는 돌연변이체를 사용하였을 때에는 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1이 약하게 결합하는 것으로 관찰되어 PTK6의 활성이 ARAP1 ARAP1과의 과의 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할수 있었다 있었다. 이들 결합에는 PTK6 PTK6의 SH2 부위가 필수적이었으며 필수적이었으며,SH2 부위 중에서도 인산화된 tyrosine tyrosine을 인식하는 R105 아미노산잔기가 관여함을 알 수 있었다 있었다. 그리고 그리고, PTK6 PTK6를 세포막 또는 핵속에 위치하도록 변형시켰을 때 PTK6 PTK6와 ARAP1 ARAP1의과 의과 결합이 감소하는 것으로 보아 보아, ARAP1 ARAP1은 세포질에 있는 PTK6 PTK6와 결합할 것으로 생각된다 생각된다. 이러한 결과로부터 PTK6 PTK6가 ARAP1 ARAP1과 결합함으로써세포 이동에 관여할 것으로 보인다 보인다.
Protein Tyrosine Kinase-6 (PTK6; also known as Brk) is a non-receptor tyrosine kinase with SH3, SH2, and catalytic domains. PTK6 has been known to be overexpressed in more than 60% of breast tumors. In an attempt to understand the role of PTK6, I have analyzed proteins interacting with PTK6 by expre...
Protein Tyrosine Kinase-6 (PTK6; also known as Brk) is a non-receptor tyrosine kinase with SH3, SH2, and catalytic domains. PTK6 has been known to be overexpressed in more than 60% of breast tumors. In an attempt to understand the role of PTK6, I have analyzed proteins interacting with PTK6 by expression of a Flag-tagged PTK6 in HEK 293 cells and then pull-down assay with Flag antibody-conjugated agarose. The pull-down proteins which were identified by MALDI-TOF mass spectrometry were Arf-GAP, Rho-GAP, ankyrin repeat, and pleckstrin homology domains-containing protein 1 (ARAP1; also known as Centaurin delta-2 or CENTD2), Kinesin family member 11, Unnamed protein (accession number: BAB14088.1), Heat shock protein 90-alpha, and Sam68. Among the interacting proteins, ARAP1, which was known to play a role in inhibition of cell spreading, was found from a 164-kDa band. I demonstrated that ARAP1 associates with PTK6 in the EGF-dependent manner and that the interaction is dependent on catalytic activity of EGFR as well as PTK6. In addition, ARAP1 associates with the SH2 domain of PTK6. Especially, the R-105 residue within the SH2 domain of PTK6 which contacts with the phosphate group on the tyrosine residue was essential for the association. Localization of PTK6 to plasma membrane or to nucleus reduced interaction of PTK6 to ARAP1, indicating that interaction of PTK6 and ARAP1 occurs mainly in cytoplasm. From these results, I suggest that PTK6 may modulate cell movement by interaction with ARAP1 which coordinates Arf-, Rho-, and phosphoinositide-mediated cell signaling.
Protein Tyrosine Kinase-6 (PTK6; also known as Brk) is a non-receptor tyrosine kinase with SH3, SH2, and catalytic domains. PTK6 has been known to be overexpressed in more than 60% of breast tumors. In an attempt to understand the role of PTK6, I have analyzed proteins interacting with PTK6 by expression of a Flag-tagged PTK6 in HEK 293 cells and then pull-down assay with Flag antibody-conjugated agarose. The pull-down proteins which were identified by MALDI-TOF mass spectrometry were Arf-GAP, Rho-GAP, ankyrin repeat, and pleckstrin homology domains-containing protein 1 (ARAP1; also known as Centaurin delta-2 or CENTD2), Kinesin family member 11, Unnamed protein (accession number: BAB14088.1), Heat shock protein 90-alpha, and Sam68. Among the interacting proteins, ARAP1, which was known to play a role in inhibition of cell spreading, was found from a 164-kDa band. I demonstrated that ARAP1 associates with PTK6 in the EGF-dependent manner and that the interaction is dependent on catalytic activity of EGFR as well as PTK6. In addition, ARAP1 associates with the SH2 domain of PTK6. Especially, the R-105 residue within the SH2 domain of PTK6 which contacts with the phosphate group on the tyrosine residue was essential for the association. Localization of PTK6 to plasma membrane or to nucleus reduced interaction of PTK6 to ARAP1, indicating that interaction of PTK6 and ARAP1 occurs mainly in cytoplasm. From these results, I suggest that PTK6 may modulate cell movement by interaction with ARAP1 which coordinates Arf-, Rho-, and phosphoinositide-mediated cell signaling.
주제어
#ARAP1
#EGF
#interacting protein
#PTK6
#SH2 domain
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