동위원소 희석 액체크로마토그래피 질량분석법을 이용한 음료수 중 안식향산, 파라옥시안식향산프로필 및 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석 Development of Isotope Dilution Liquid Chromatography Mass Spectrometry for the Determination of Benzoic acid, Propyl ρ-hydroxybenzoate in Quasi-Drug Drink and Acrylamide in Potato Chips원문보기
안식향산 및 파라옥시안식향산프로필은 인체에 거의 해가 없는 농도에서도 세균, 효모, 곰팡이들의 성장을 억제하여주는 작용을 갖고 있기 때문에 우리나라와 미국, 일본 등을 비롯하여 많은 나라에서 식품보존제(식품첨가물)로 현재 널리 사용되고 있다. 하지만 여러 종류의 식료품에 무분별하게 첨가되어 있어 보존제를 섭취하는 양이 갈수록 늘어나고 있다. 이 보존제는 계속적인 흡수로 인해 알레르기반응과 간질병의 경련, 피부와 눈, 적막에 자극을 주는 등의 부작용을 초래한다.
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안식향산 및 파라옥시안식향산프로필은 인체에 거의 해가 없는 농도에서도 세균, 효모, 곰팡이들의 성장을 억제하여주는 작용을 갖고 있기 때문에 우리나라와 미국, 일본 등을 비롯하여 많은 나라에서 식품보존제(식품첨가물)로 현재 널리 사용되고 있다. 하지만 여러 종류의 식료품에 무분별하게 첨가되어 있어 보존제를 섭취하는 양이 갈수록 늘어나고 있다. 이 보존제는 계속적인 흡수로 인해 알레르기반응과 간질병의 경련, 피부와 눈, 적막에 자극을 주는 등의 부작용을 초래한다. 안식향산나트륨의 경우 비타민 음료수에 들어가는 비타민 C(아스코르브산ㆍAscorbic Acid)와 안식향산나트륨(안식향산방부제ㆍSodium Benzoate)이 혼합될 경우 인체에 유해물질인 벤젠을 형성할 수 있다는 미국 식품의약품안전청의 연구 결과를 확인하기 위해 우리나라에서도 시중의 비타민 음료수를 대상으로 조사를 실시하였으며, 조사 결과 대부분의 제품에서 벤젠이 검출돼 음료 제조시 이 두 성분을 같이 사용하지 않도록 제조방법을 개선하도록 하였다. 이외에도 많이 사용되는 보존제인 파라옥시안식향산프로필의 경우 CODEX 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서는 식품첨가물로 지정되어 있지 않는 보존제로 간장과 식초, 과실ㆍ채소음료 등에 널리 쓰이고 있는 보존제이다. 최근 이것은 EU를 비롯한 국내외 연구결과 지나치게 섭취할 경우 내분비계 및 생식계에 독성을 유발할 수 있다는 우려가 제기되어, 2007년 식품의약품안정청은 이것에 대한 안정성 재평가를 통하여 2008년 6월 보존료 목적으로 사용되는 파라옥시안식향산프로필에 대해 지정을 취소하였다.
이렇듯 최근 식품보존제(식품첨가물)에 대한 소비자의 관심이 증대됨에 따라 소비자단체 등에서 식품첨가물의 안전성 문제를 지속적으로 제기하고 있으며, 오남용 등으로 인한 소비자의 막연한 불안감이 커지고 있는 실정이다. 이런 불안감 회소를 위해 최근 연구에서는 비교적 경제적인 경비와 짧은 시간에 정밀한 분석결과를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있는 액체크로마토그래피를 통한 질량분석법을 사용하여음료중 보존제를 분석하기 위한 분석법으로 널리 사용되고 있다.
본 연구에서는 음료수 중 안식향산 및 파라옥시안식향산프로필 분리분석을 위하여 절대측정법(Definitive Reference Method)으로 이들 분석물질들의 동위원소를 이용한 동위원소 희석 액체크로마토그래피 질량분석법 (Isotope Dilution Liquid Chromatography Mass Spectrometry)을 개발하였다. 질량분석법(Mass Spectrometry)은 음이온모드로 운영하였으며 C18 컬럼을 사용하였다. 이동상의 pH에 따른 액체크로마토그래피(Liquid Chromatography) 혼합물의 분리와 전자분무이온화법(Electrospray Ionization)에 의해 이온화 효율을 관찰하여 pH 조건을 최적화하였다. 또한 본 실험방법을 통하여 시중에 판매되는 음료중의 보존제에 대한 결과를 보고하고자 한다.
실험 방법으로 안식향산과 파라옥시안식향산프로필이 첨가되어있는 음료수에 동위원소표준용액을 첨가한 후 0.22 ㎛ nylon membrane 필터로 간단히 전처리를 수행하였다.
본 연구는 최종적으로 음료중에 속해있는 모든 보존제들의 동시 분리분석을 위한 전처리법을 확립하고 이를 바탕으로 동위원소를 이용하여 전처리 과정의 회수율 및 기기 감도를 보정하는 절대측정법을 개발하고자 한다. 개발된 분석법의 유효성을 확인하기 위하여 LC/MS/MS의 결과를 비교하여 측정의 정확도, 반복성 및 재현성을 높여 이 절대측정법이 음료중의 보존제 분석의 기준 분석법으로 활용 되도록 하고자 한다. 아크릴아마이드는 동물 실험에서 발암을 일으키는 것으로 알려져 왔으며, 특정양 이상 섭취 시 동물과 사람의 신경계에 독성을 나타낸다.
한국표준과학연구원에서는 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석을 위해 연구를 진행하여 본 연구소에서는 감자 칩 속 아크릴아마이드 인증표준물질을 제조하여, 이 인증표준물질에 대한 인증값을 확립하고자 하였다. 하지만 국제비교를 위해 시료 배포를 앞두고 분석방법에 대한 문제점을 발견이 되었다. 문제는 다름 아닌 아크릴아마이드 분석 전처리 과정의 한부분에서 비롯되었다. 아크릴아마이드는 고온(120 ℃ 이상의 온도에서 형성되기 시작해 160 ~ 180 ℃에서 가장 많은 양이 생성되었고 200 ℃ 이상의 고온에서는 그 양이 다시 감소)에서 생성되게 되는데 기존의 시료 전처리 방법은 물 중탕을 사용하여 전처리를 하는 방식이었다. 물의 끓는점이 100 ℃ 이므로 고온에서 생성되는 아크릴아마이드의 특성상 전처리 과정 중에서도 충분히 생성 될 수 있을 것이다. 이 전처리 과정의 문제점을 확인하고 해결하기 위해 물중탕을 이용한 전처리방법과 TurboVap(온도 55 oC, 질소 퍼지)을 이용한 전처리방법을 비교하여 그 결과 값을 비교하며, 감자 칩 인증표준물질에 대한 분석방법을 확립하고 인증값을 산출하고자 한다. 인증값은 국제비교의 결과값으로 사용하였으며 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석법의 신뢰도와 정확성을 입증하였다.
실험 방법으로는 3 g의 시료에 정확히 계산된 아크릴아마이드 동위원소표준용액을 첨가한 후 H2O 30 ㎖을 첨가한 후 균질화 시킨 후 원심분리기에 넣고 약 4000 rpm의 속도로 20 분간 원심분리하여 층을 분리한다. 원심분리 된 세 층(상층부부터 기름층, 용액층, 침전층) 중에서 가운데층인 수용액층을 추출해낸 후 단백질 제거를 위해 acetonitrile을 5-6 ㎖ 첨가해준다. 하얀 단백질이 생기는 것을 확인한 후 원심분리기에 넣고 약 4000 rpm으로 15분간 원심분리하여 층을 분리한다. 분리된 위 층 용액을 모두 추출해서 TurboVap(온도 55 oC, 질소 퍼지)을 사용하여 1 ㎖로 농축시킨 후 고체상 카트리지 Waters의 Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance reversed-phase sorbent, 6 cc 200 mg) 와 Oasis MCX(Mixed-mode : Cation Exchange and reversed-phase sorbent, 6 cc 150 mg)을 이용하여 고체상 추출을 하였다.
아크릴아마이드 연구는 최종적으로 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석을 위해 동위원소 희석법을 이용하여 분석의 정확성을 높였으며, 반복성 및 재현성을 높여 감자 칩 속 아크릴아마이드분석의 기준분석법으로 활용되도록 하고자 한다.
안식향산 및 파라옥시안식향산프로필은 인체에 거의 해가 없는 농도에서도 세균, 효모, 곰팡이들의 성장을 억제하여주는 작용을 갖고 있기 때문에 우리나라와 미국, 일본 등을 비롯하여 많은 나라에서 식품보존제(식품첨가물)로 현재 널리 사용되고 있다. 하지만 여러 종류의 식료품에 무분별하게 첨가되어 있어 보존제를 섭취하는 양이 갈수록 늘어나고 있다. 이 보존제는 계속적인 흡수로 인해 알레르기반응과 간질병의 경련, 피부와 눈, 적막에 자극을 주는 등의 부작용을 초래한다.
안식향산나트륨의 경우 비타민 음료수에 들어가는 비타민 C(아스코르브산ㆍAscorbic Acid)와 안식향산나트륨(안식향산방부제ㆍSodium Benzoate)이 혼합될 경우 인체에 유해물질인 벤젠을 형성할 수 있다는 미국 식품의약품안전청의 연구 결과를 확인하기 위해 우리나라에서도 시중의 비타민 음료수를 대상으로 조사를 실시하였으며, 조사 결과 대부분의 제품에서 벤젠이 검출돼 음료 제조시 이 두 성분을 같이 사용하지 않도록 제조방법을 개선하도록 하였다. 이외에도 많이 사용되는 보존제인 파라옥시안식향산프로필의 경우 CODEX 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서는 식품첨가물로 지정되어 있지 않는 보존제로 간장과 식초, 과실ㆍ채소음료 등에 널리 쓰이고 있는 보존제이다. 최근 이것은 EU를 비롯한 국내외 연구결과 지나치게 섭취할 경우 내분비계 및 생식계에 독성을 유발할 수 있다는 우려가 제기되어, 2007년 식품의약품안정청은 이것에 대한 안정성 재평가를 통하여 2008년 6월 보존료 목적으로 사용되는 파라옥시안식향산프로필에 대해 지정을 취소하였다.
이렇듯 최근 식품보존제(식품첨가물)에 대한 소비자의 관심이 증대됨에 따라 소비자단체 등에서 식품첨가물의 안전성 문제를 지속적으로 제기하고 있으며, 오남용 등으로 인한 소비자의 막연한 불안감이 커지고 있는 실정이다. 이런 불안감 회소를 위해 최근 연구에서는 비교적 경제적인 경비와 짧은 시간에 정밀한 분석결과를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있는 액체크로마토그래피를 통한 질량분석법을 사용하여음료중 보존제를 분석하기 위한 분석법으로 널리 사용되고 있다.
본 연구에서는 음료수 중 안식향산 및 파라옥시안식향산프로필 분리분석을 위하여 절대측정법(Definitive Reference Method)으로 이들 분석물질들의 동위원소를 이용한 동위원소 희석 액체크로마토그래피 질량분석법 (Isotope Dilution Liquid Chromatography Mass Spectrometry)을 개발하였다. 질량분석법(Mass Spectrometry)은 음이온모드로 운영하였으며 C18 컬럼을 사용하였다. 이동상의 pH에 따른 액체크로마토그래피(Liquid Chromatography) 혼합물의 분리와 전자분무이온화법(Electrospray Ionization)에 의해 이온화 효율을 관찰하여 pH 조건을 최적화하였다. 또한 본 실험방법을 통하여 시중에 판매되는 음료중의 보존제에 대한 결과를 보고하고자 한다.
실험 방법으로 안식향산과 파라옥시안식향산프로필이 첨가되어있는 음료수에 동위원소표준용액을 첨가한 후 0.22 ㎛ nylon membrane 필터로 간단히 전처리를 수행하였다.
본 연구는 최종적으로 음료중에 속해있는 모든 보존제들의 동시 분리분석을 위한 전처리법을 확립하고 이를 바탕으로 동위원소를 이용하여 전처리 과정의 회수율 및 기기 감도를 보정하는 절대측정법을 개발하고자 한다. 개발된 분석법의 유효성을 확인하기 위하여 LC/MS/MS의 결과를 비교하여 측정의 정확도, 반복성 및 재현성을 높여 이 절대측정법이 음료중의 보존제 분석의 기준 분석법으로 활용 되도록 하고자 한다.
아크릴아마이드는 동물 실험에서 발암을 일으키는 것으로 알려져 왔으며, 특정양 이상 섭취 시 동물과 사람의 신경계에 독성을 나타낸다.
한국표준과학연구원에서는 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석을 위해 연구를 진행하여 본 연구소에서는 감자 칩 속 아크릴아마이드 인증표준물질을 제조하여, 이 인증표준물질에 대한 인증값을 확립하고자 하였다. 하지만 국제비교를 위해 시료 배포를 앞두고 분석방법에 대한 문제점을 발견이 되었다. 문제는 다름 아닌 아크릴아마이드 분석 전처리 과정의 한부분에서 비롯되었다. 아크릴아마이드는 고온(120 ℃ 이상의 온도에서 형성되기 시작해 160 ~ 180 ℃에서 가장 많은 양이 생성되었고 200 ℃ 이상의 고온에서는 그 양이 다시 감소)에서 생성되게 되는데 기존의 시료 전처리 방법은 물 중탕을 사용하여 전처리를 하는 방식이었다. 물의 끓는점이 100 ℃ 이므로 고온에서 생성되는 아크릴아마이드의 특성상 전처리 과정 중에서도 충분히 생성 될 수 있을 것이다. 이 전처리 과정의 문제점을 확인하고 해결하기 위해 물중탕을 이용한 전처리방법과 TurboVap(온도 55 oC, 질소 퍼지)을 이용한 전처리방법을 비교하여 그 결과 값을 비교하며, 감자 칩 인증표준물질에 대한 분석방법을 확립하고 인증값을 산출하고자 한다. 인증값은 국제비교의 결과값으로 사용하였으며 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석법의 신뢰도와 정확성을 입증하였다.
실험 방법으로는 3 g의 시료에 정확히 계산된 아크릴아마이드 동위원소표준용액을 첨가한 후 H2O 30 ㎖을 첨가한 후 균질화 시킨 후 원심분리기에 넣고 약 4000 rpm의 속도로 20 분간 원심분리하여 층을 분리한다. 원심분리 된 세 층(상층부부터 기름층, 용액층, 침전층) 중에서 가운데층인 수용액층을 추출해낸 후 단백질 제거를 위해 acetonitrile을 5-6 ㎖ 첨가해준다. 하얀 단백질이 생기는 것을 확인한 후 원심분리기에 넣고 약 4000 rpm으로 15분간 원심분리하여 층을 분리한다. 분리된 위 층 용액을 모두 추출해서 TurboVap(온도 55 oC, 질소 퍼지)을 사용하여 1 ㎖로 농축시킨 후 고체상 카트리지 Waters의 Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance reversed-phase sorbent, 6 cc 200 mg) 와 Oasis MCX(Mixed-mode : Cation Exchange and reversed-phase sorbent, 6 cc 150 mg)을 이용하여 고체상 추출을 하였다.
아크릴아마이드 연구는 최종적으로 감자 칩 속 아크릴아마이드 분석을 위해 동위원소 희석법을 이용하여 분석의 정확성을 높였으며, 반복성 및 재현성을 높여 감자 칩 속 아크릴아마이드분석의 기준분석법으로 활용되도록 하고자 한다.
An analytical method was developed for the accurate determination of benzoic acid in commercial quasi-drug drinks using isotope dilution liquid chromatography mass spectrometry (ID-LC/MS).
Sample drinks were spiked with 13C6-benzoic acid and these mixtures were cleaned by a nylon membrane filt...
An analytical method was developed for the accurate determination of benzoic acid in commercial quasi-drug drinks using isotope dilution liquid chromatography mass spectrometry (ID-LC/MS).
Sample drinks were spiked with 13C6-benzoic acid and these mixtures were cleaned by a nylon membrane filter. The sample mixtures were then analyzed using LC/Tandem MS in the negative ion mode without further clean-up or extraction steps. For the chromatographic separation, a C18 column with isocratic mobile phase of 50:50 (v/v) 5 mM ammonium acetate buffer at pH 4.5 and methanol mixture was used.
MS was operated with electrospray ionization in the negative mode. Benzoic acid and its isotope analogue were detected by selectively monitoring the collisionally-induced dissociation channels of [M-H]- [M-HCO2]- at m/z 121 -> 77 and m/z 127 -> 83, respectively.
Repeatability and reproducibility studies showed that the ID-LC/MS/MS method is a reliable and reproducible method which can provide less than 0.3 % of relative standard deviation (RSTD) of method precisionfor analysis of benzoic acid.
An analytical method was developed for the accurate determination of benzoic acid in commercial quasi-drug drinks using isotope dilution liquid chromatography mass spectrometry (ID-LC/MS).
Sample drinks were spiked with 13C6-benzoic acid and these mixtures were cleaned by a nylon membrane filter. The sample mixtures were then analyzed using LC/Tandem MS in the negative ion mode without further clean-up or extraction steps. For the chromatographic separation, a C18 column with isocratic mobile phase of 50:50 (v/v) 5 mM ammonium acetate buffer at pH 4.5 and methanol mixture was used.
MS was operated with electrospray ionization in the negative mode. Benzoic acid and its isotope analogue were detected by selectively monitoring the collisionally-induced dissociation channels of [M-H]- [M-HCO2]- at m/z 121 -> 77 and m/z 127 -> 83, respectively.
Repeatability and reproducibility studies showed that the ID-LC/MS/MS method is a reliable and reproducible method which can provide less than 0.3 % of relative standard deviation (RSTD) of method precisionfor analysis of benzoic acid.
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