GMO에 대한 안전성 평가에 대한 관리가 요구되는 가운데 본 연구를 통해 다양한 안전성 평가에 활용될 수 있는 재조합 단백질을 발현하여 순수하게 분리하였다. GM작물에 삽입된 gat4601, nptII 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후 발현벡터인 pET-15b에 클로닝하였다. 클로닝 된 벡터를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 한 후 18℃ 혹은 37℃의 조건에서 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적하는 각각의 단백질을 발현하였다. 발현 여부는 클로닝한 pET-15b 벡터에 His-tag을 포함하고 있기 때문에 His-antibody를 이용한 western blotting으로 확인하였다. 발현이 확인된 배양액은 His ...
GMO에 대한 안전성 평가에 대한 관리가 요구되는 가운데 본 연구를 통해 다양한 안전성 평가에 활용될 수 있는 재조합 단백질을 발현하여 순수하게 분리하였다. GM작물에 삽입된 gat4601, nptII 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후 발현벡터인 pET-15b에 클로닝하였다. 클로닝 된 벡터를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 한 후 18℃ 혹은 37℃의 조건에서 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적하는 각각의 단백질을 발현하였다. 발현 여부는 클로닝한 pET-15b 벡터에 His-tag을 포함하고 있기 때문에 His-antibody를 이용한 western blotting으로 확인하였다. 발현이 확인된 배양액은 His affinity chromatography를 이용하여 목적하는 단백질 분리하였다. Barnase의 경우, RNase의 역할을 하기 때문에 단백질의 합성을 방해하여 inhibitor 인 Barstar와 발현을 진행하였다. Barnase는 SP ion exchange chromatography를 이용하여 목적하는 단백질을 분리하였고, RNase assay를 통해 Barnase 단백질을 최종 확인 하였다.
이렇게 분리된 단백질들은 GMO로 인한 알레르기 발생이 의심될 경우, 원인조사 즉 환자 알레르기 진단을 위한 표지단백질로 활용할 수 있으며, 새로운 단백질에 대한 알레르기 유발가능성 및 소화성을 조사 평가하기 위한 표준시료로 활용 가능하다. 또한 순수 정제한 재조합단백질은 각각의 단백질을 항원으로 하는 항체제작에 활용되며, 추후 GMO 검출 실험에서 DNA를 이용한 검출실험 뿐만 아니라 이렇게 제작된 항체를 이용하여 재조합 단백질을 검출하는 실험에 응용할 수 있다.
GMO에 대한 안전성 평가에 대한 관리가 요구되는 가운데 본 연구를 통해 다양한 안전성 평가에 활용될 수 있는 재조합 단백질을 발현하여 순수하게 분리하였다. GM작물에 삽입된 gat4601, nptII 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후 발현벡터인 pET-15b에 클로닝하였다. 클로닝 된 벡터를 E.coli BL21(DE3)에 형질전환 한 후 18℃ 혹은 37℃의 조건에서 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적하는 각각의 단백질을 발현하였다. 발현 여부는 클로닝한 pET-15b 벡터에 His-tag을 포함하고 있기 때문에 His-antibody를 이용한 western blotting으로 확인하였다. 발현이 확인된 배양액은 His affinity chromatography를 이용하여 목적하는 단백질 분리하였다. Barnase의 경우, RNase의 역할을 하기 때문에 단백질의 합성을 방해하여 inhibitor 인 Barstar와 발현을 진행하였다. Barnase는 SP ion exchange chromatography를 이용하여 목적하는 단백질을 분리하였고, RNase assay를 통해 Barnase 단백질을 최종 확인 하였다.
이렇게 분리된 단백질들은 GMO로 인한 알레르기 발생이 의심될 경우, 원인조사 즉 환자 알레르기 진단을 위한 표지단백질로 활용할 수 있으며, 새로운 단백질에 대한 알레르기 유발가능성 및 소화성을 조사 평가하기 위한 표준시료로 활용 가능하다. 또한 순수 정제한 재조합단백질은 각각의 단백질을 항원으로 하는 항체제작에 활용되며, 추후 GMO 검출 실험에서 DNA를 이용한 검출실험 뿐만 아니라 이렇게 제작된 항체를 이용하여 재조합 단백질을 검출하는 실험에 응용할 수 있다.
The genes inserted in genetically modified (GM) crops were cloned into barterial expression vector, pET-15b. Among the GM crops, the three genes including gat4601, nptII gene from each events (DP356043-1, MON863) were selected and full sequences were amplified with each primer pairs using PCR. Each ...
The genes inserted in genetically modified (GM) crops were cloned into barterial expression vector, pET-15b. Among the GM crops, the three genes including gat4601, nptII gene from each events (DP356043-1, MON863) were selected and full sequences were amplified with each primer pairs using PCR. Each amplified products were inserted into the pET-15b vector and verified with sequenced data. The constructed vectors were transformed into E.coli BL21 (DE3) and over-expressed under IPTG induction. The IPTG induced proteins were electrophoresed using SDS-PAGE and the overexpressed target proteins were confirmed with western blotting using His-tag antibody. In case of Barnase, expressed using pMT416 plasmid and purified using SP ion exchange chromatography. Each target protein was shown to have an exact size of 16 kDa (GAT4601 in DP356043-1), 29 kDa (NPTII in MON863) and 12.5 kDa (Barnase in Ms8) respectively.
The genes inserted in genetically modified (GM) crops were cloned into barterial expression vector, pET-15b. Among the GM crops, the three genes including gat4601, nptII gene from each events (DP356043-1, MON863) were selected and full sequences were amplified with each primer pairs using PCR. Each amplified products were inserted into the pET-15b vector and verified with sequenced data. The constructed vectors were transformed into E.coli BL21 (DE3) and over-expressed under IPTG induction. The IPTG induced proteins were electrophoresed using SDS-PAGE and the overexpressed target proteins were confirmed with western blotting using His-tag antibody. In case of Barnase, expressed using pMT416 plasmid and purified using SP ion exchange chromatography. Each target protein was shown to have an exact size of 16 kDa (GAT4601 in DP356043-1), 29 kDa (NPTII in MON863) and 12.5 kDa (Barnase in Ms8) respectively.
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