국내의 극한환경에서 해수, 흙, 진흙, 온천수 등을 채취하여 채취한 지역의 특성에 따라서 호염성, 고온성 그리고 중온성으로 나누어서 미생물을 분리하였다.호염성은염농도를 10~25%(w/v)까지 배지에 첨가하여 배양하였고, 고온성은 배양온도를 60℃, 70℃로 설정하여 배양 결과 호염성균은 144종의 균주를,고온성균은 231종의균주 그리고 중온성균은 69종의 균주를 분리하여 총 444종의 균주를 분리하였다. 분리한 균주들을 이용하여 protease와 chitinase생산균주를 탐색한 결과protease를 생산하는호염성균주가 36종, 고온성균주가 64종 그리고 중온성균주가 35종, 총 134균주를 스크리닝하였다.Chitinase를 생산해내는 균주는호염성균주가 1균주, 고온성균주에서 2균주 그리고 중온성균주에서 14균주를 스크리닝하여 총17 균주를 스크리닝하였다. Culture independent enzyme 유전자 스크리닝에서는 L-arabinose isomerase(araA) 유전자와 pyruvate kinase(pyrK) 유전자를 타겟으로Ci PCR이란 방법을 사용하였고, 서로 다른 균주 26종을 선별하여 진행하였다. 그 결과araA 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 7종,고온성균주는 11종을스크리닝 하였고, pyrK 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 9종, 고온성균주는 11종이 확인되었으며, 이상의 결과들은 모두 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 스크리닝한균주들 중 GeobacilluskaustophilusaraA 유전자를 ...
국내의 극한환경에서 해수, 흙, 진흙, 온천수 등을 채취하여 채취한 지역의 특성에 따라서 호염성, 고온성 그리고 중온성으로 나누어서 미생물을 분리하였다.호염성은염농도를 10~25%(w/v)까지 배지에 첨가하여 배양하였고, 고온성은 배양온도를 60℃, 70℃로 설정하여 배양 결과 호염성균은 144종의 균주를,고온성균은 231종의균주 그리고 중온성균은 69종의 균주를 분리하여 총 444종의 균주를 분리하였다. 분리한 균주들을 이용하여 protease와 chitinase생산균주를 탐색한 결과protease를 생산하는호염성균주가 36종, 고온성균주가 64종 그리고 중온성균주가 35종, 총 134균주를 스크리닝하였다.Chitinase를 생산해내는 균주는호염성균주가 1균주, 고온성균주에서 2균주 그리고 중온성균주에서 14균주를 스크리닝하여 총17 균주를 스크리닝하였다. Culture independent enzyme 유전자 스크리닝에서는 L-arabinose isomerase(araA) 유전자와 pyruvate kinase(pyrK) 유전자를 타겟으로Ci PCR이란 방법을 사용하였고, 서로 다른 균주 26종을 선별하여 진행하였다. 그 결과araA 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 7종,고온성균주는 11종을스크리닝 하였고, pyrK 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 9종, 고온성균주는 11종이 확인되었으며, 이상의 결과들은 모두 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 스크리닝한균주들 중 GeobacilluskaustophilusaraA 유전자를 Genome 서열로부터 PCR cloning한 후, 이를 대장균에서 발현하여G. kaustophilus L-arabinose isomerase(GKAI)의 특성을 살펴보았다. GKAI는 고온균 유래의 효소특성과 같이 고온에서 매우 안정적인 활성을 나타내었는데 70℃에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 60℃에서도 80%이상의 활성을 나타내었다. GKAI는 약알칼리성인 pH8에서 최적의 활성을 나타내었으며, 보통의 고온성 유래의 AI들이 금속이온을 필요로 하기 때문에, GKAI에CoCl2, MnCl2, MgCl2, ZnCl2, NiCl2다섯가지 금속이온을 첨가하여 활성을 측정하였는데, 오히려 금속이온들이 GKAI의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.이는 고온성 유래의 AI들이 금속의존성을 가지고 있다는 단점을 극복할 수 있으며 식품산업에 응용에 매우 큰 강점으로 작용하여 D-tagatose를 생산하는 공정에 매우 유용하게 적용될 수 있을 것이라 판단된다.
국내의 극한환경에서 해수, 흙, 진흙, 온천수 등을 채취하여 채취한 지역의 특성에 따라서 호염성, 고온성 그리고 중온성으로 나누어서 미생물을 분리하였다.호염성은염농도를 10~25%(w/v)까지 배지에 첨가하여 배양하였고, 고온성은 배양온도를 60℃, 70℃로 설정하여 배양 결과 호염성균은 144종의 균주를,고온성균은 231종의균주 그리고 중온성균은 69종의 균주를 분리하여 총 444종의 균주를 분리하였다. 분리한 균주들을 이용하여 protease와 chitinase생산균주를 탐색한 결과protease를 생산하는호염성균주가 36종, 고온성균주가 64종 그리고 중온성균주가 35종, 총 134균주를 스크리닝하였다.Chitinase를 생산해내는 균주는호염성균주가 1균주, 고온성균주에서 2균주 그리고 중온성균주에서 14균주를 스크리닝하여 총17 균주를 스크리닝하였다. Culture independent enzyme 유전자 스크리닝에서는 L-arabinose isomerase(araA) 유전자와 pyruvate kinase(pyrK) 유전자를 타겟으로Ci PCR이란 방법을 사용하였고, 서로 다른 균주 26종을 선별하여 진행하였다. 그 결과araA 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 7종,고온성균주는 11종을스크리닝 하였고, pyrK 유전자를 가지고 있는 것으로 확인된 호염성균주는 9종, 고온성균주는 11종이 확인되었으며, 이상의 결과들은 모두 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 스크리닝한균주들 중 GeobacilluskaustophilusaraA 유전자를 Genome 서열로부터 PCR cloning한 후, 이를 대장균에서 발현하여G. kaustophilus L-arabinose isomerase(GKAI)의 특성을 살펴보았다. GKAI는 고온균 유래의 효소특성과 같이 고온에서 매우 안정적인 활성을 나타내었는데 70℃에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 60℃에서도 80%이상의 활성을 나타내었다. GKAI는 약알칼리성인 pH8에서 최적의 활성을 나타내었으며, 보통의 고온성 유래의 AI들이 금속이온을 필요로 하기 때문에, GKAI에CoCl2, MnCl2, MgCl2, ZnCl2, NiCl2다섯가지 금속이온을 첨가하여 활성을 측정하였는데, 오히려 금속이온들이 GKAI의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.이는 고온성 유래의 AI들이 금속의존성을 가지고 있다는 단점을 극복할 수 있으며 식품산업에 응용에 매우 큰 강점으로 작용하여 D-tagatose를 생산하는 공정에 매우 유용하게 적용될 수 있을 것이라 판단된다.
Extremophiles were isolated from various environments including sea water, soils, mud, and hot springs and classified in halophiles, thermophiles, and mesophiles. Halophiles were cultivated of adding salt concentrate 10~25%(w/v), while thermophiles and mesophiles were cultivated at higher than 60℃ a...
Extremophiles were isolated from various environments including sea water, soils, mud, and hot springs and classified in halophiles, thermophiles, and mesophiles. Halophiles were cultivated of adding salt concentrate 10~25%(w/v), while thermophiles and mesophiles were cultivated at higher than 60℃ and lower than 37℃ respectively. As a result, 144 strains in halophiles, 231 strains in thermophiles, and 69 strains in mesophiles were isolated and totally 444 strains were isolated from all samples. From culture dependent enzyme screening for protease, we isolated 36 strains of protease producing halophiles, while 64 strains of thermophiles and 35 strains of mesophiles were isolated. Also we found one chitinase producing strains in halophiles and two thermophiles strains. To test whether these thermophilic isolates are useful resources for screening of industrial enzymes, we chose L-arabinose isomerases (AI) and pyruvate kinase. Specific degenerate primers based on the conserved amino acid sequences of homologues were used to screen araA genes pyrK. Strains that have araA and pyrK were detedcted in halophiles and thermophiles successfully. As an example of enzyme screening, Geobacillus kaustophilus araA gene was cloned and overexpressed in E. coli. After purification through affinity column chromatography and ion-exchange chromatography, we characterized of recombinant L-arabinose isomerase from G. Kaustophilus(GKAI). Like other enzymes from thermophilic microorganisms, L-arabinose isomerase from G. kaustophilus was stable at high temperature. The highest activity was shown in 70℃and more than 80% of activity were observed in 60℃. In addition, GKAI showed the highest activity in the alkaline pH8. Generally L-arabinose isomerases from thermophilic microorganisms use metal ions as a cofactor. However, most of metal ions inhibited GKAI activity.
Extremophiles were isolated from various environments including sea water, soils, mud, and hot springs and classified in halophiles, thermophiles, and mesophiles. Halophiles were cultivated of adding salt concentrate 10~25%(w/v), while thermophiles and mesophiles were cultivated at higher than 60℃ and lower than 37℃ respectively. As a result, 144 strains in halophiles, 231 strains in thermophiles, and 69 strains in mesophiles were isolated and totally 444 strains were isolated from all samples. From culture dependent enzyme screening for protease, we isolated 36 strains of protease producing halophiles, while 64 strains of thermophiles and 35 strains of mesophiles were isolated. Also we found one chitinase producing strains in halophiles and two thermophiles strains. To test whether these thermophilic isolates are useful resources for screening of industrial enzymes, we chose L-arabinose isomerases (AI) and pyruvate kinase. Specific degenerate primers based on the conserved amino acid sequences of homologues were used to screen araA genes pyrK. Strains that have araA and pyrK were detedcted in halophiles and thermophiles successfully. As an example of enzyme screening, Geobacillus kaustophilus araA gene was cloned and overexpressed in E. coli. After purification through affinity column chromatography and ion-exchange chromatography, we characterized of recombinant L-arabinose isomerase from G. Kaustophilus(GKAI). Like other enzymes from thermophilic microorganisms, L-arabinose isomerase from G. kaustophilus was stable at high temperature. The highest activity was shown in 70℃and more than 80% of activity were observed in 60℃. In addition, GKAI showed the highest activity in the alkaline pH8. Generally L-arabinose isomerases from thermophilic microorganisms use metal ions as a cofactor. However, most of metal ions inhibited GKAI activity.
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