본 연구에서는 팔레놉시스의 대량증식 체계와 Agrobacterium 및 particle bombardment 방법을 이용하여 형질전환 체계를 확립하고 노화지연 식물체를 생산에 대한 연구를 하였다. 대량증식 체계 확립에 대한 실험에서 식물 재료는 강산농원에서 분양받은 ‘KNO21’ 품종을 사용하였고 배지 종류 실험 (VW, HCa, Knudson C, Orchimax)을 실시하였을 때 VW 배지에서 재분화율이 74.0±2.2 %로 가장 효과가 좋았다. 액체 고체 형태에 따른 PLB의 생장을 비교한 결과 고체배지에서 신초발생율은 36.3 %로 액체 배지보다 1.7 % 높았으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. ...
본 연구에서는 팔레놉시스의 대량증식 체계와 Agrobacterium 및 particle bombardment 방법을 이용하여 형질전환 체계를 확립하고 노화지연 식물체를 생산에 대한 연구를 하였다. 대량증식 체계 확립에 대한 실험에서 식물 재료는 강산농원에서 분양받은 ‘KNO21’ 품종을 사용하였고 배지 종류 실험 (VW, HCa, Knudson C, Orchimax)을 실시하였을 때 VW 배지에서 재분화율이 74.0±2.2 %로 가장 효과가 좋았다. 액체 고체 형태에 따른 PLB의 생장을 비교한 결과 고체배지에서 신초발생율은 36.3 %로 액체 배지보다 1.7 % 높았으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. Sucrose 농도에 따른 PLB 생장에 미치는 효과에 대해 농도 (0, 10, 20, 30, 40, 50 g/l)실험을 실시한 결과 10 g/l에서 30.3 %로 신초발생율을 보였다. 이를 바탕으로 PLB의 갈변 억제에 효과적인 방법을 알아보기 위해 ascorbic acid (0, 50, 100, 150, 200 mg/l)와 activated charcoal (1 g/l)를 처리하였다. 생육과 갈변억제에 가장 효과적인 처리구를 알아보기 위한 실험으로 생육과 갈변을 8주간 관찰하였다. 갈변 억제는 ascorbic acid 200 mg/l에서 가장 효과적이었지만 생육은 ascorbic acid 150 mg/l에서 가장 빠른 것을 확인하였다. activated charcoal 1 g/l처리에서는 무처리구보다 갈변이 높은 것을 확인하여 activated charcoal의 갈변 억제 효과는 확인 할 수 없었다. 형질전환 실험에서는 Agrobacterium 매개 방법과 유전자 총을 이용한 실험을 실시하였다. 먼저 형질전환 시 BASTA를 이용하여 1차적 선발을 위해 비 형질전환체를 가지고 0.01, 0.05, 0.10, 0.15 % 처리한 기본 VW배지에 증식하여 관찰하였다. 실험을 실시한 결과 BASTA가 첨가되지 않은 대조구를 제외한 모든 처리구에서 개체들이 4주차에서 대부분이 고사하여 최적의 농도를 0.01 %로 선정하여 형질전환 선발을 진행하였다. Agrobacterium 접종 처리에서는 침봉처리 실험에서 (침봉, 무침봉) 무침봉처리가 1.87±0.75 %로 침봉처리보다 형질전환 효율이 높았으며, 균 OD600 농도 처리 (0.5, 1.0, 1.5, 2.0)에서는 OD600 0.5에서 13.19±4.01 %로 가장 높은 효율을 보였다. 접종시간 비교 실험 (5, 10, 20, 30분)에서는 30분에서만 1.18±0.50 %로 형질전환체를 확인하였으며, 유전자 총 실험에서는 이격거리 (3, 6, 9 cm) 실험을 실시한 결과 이격거리 6 cm에서 약 25 %, 삼투압 처리실험에서는 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol에서 20.7±1.5개의 PPT 저항성 PLB를 확인하였으며, bombardment 횟수 (1, 2, 3회)에 따른 형질전환 비교실험에서는 2회에서 10.3 ± 1.5개의 PPT 저항성 PLB를 확인하였다. 1차적으로 선발된 PLB를 이용하여 분자적인 분석을 한 결과 ORE7 gene (936 bp)을 확인할 수 있었다. 위의 형질전환 된 개체를 가지고 재 분화를 한 후 순화까지 완료된 발육이 좋은 몇 개체에서 꽃봉오리가 맺힌 후 정상적으로 개화를 하였다. 비형질전환체와 ORE7 유전자를 가진 개체간의 특이한 사항은 없었지만 꽃봉오리 개수가 ORE7 유전자를 가진 개체에서 4-5개 가량 더 많은 것을 확인하여 이는 유전자의 발현으로 인한 결과라고 사료된다. 위의 결과들을 가지고 팔레놉시스의 대량증식 체계 및 형질전환체 생산에 대한 체계에 도움이 되는 정보가 될 것이라 판단된다.
본 연구에서는 팔레놉시스의 대량증식 체계와 Agrobacterium 및 particle bombardment 방법을 이용하여 형질전환 체계를 확립하고 노화지연 식물체를 생산에 대한 연구를 하였다. 대량증식 체계 확립에 대한 실험에서 식물 재료는 강산농원에서 분양받은 ‘KNO21’ 품종을 사용하였고 배지 종류 실험 (VW, HCa, Knudson C, Orchimax)을 실시하였을 때 VW 배지에서 재분화율이 74.0±2.2 %로 가장 효과가 좋았다. 액체 고체 형태에 따른 PLB의 생장을 비교한 결과 고체배지에서 신초발생율은 36.3 %로 액체 배지보다 1.7 % 높았으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. Sucrose 농도에 따른 PLB 생장에 미치는 효과에 대해 농도 (0, 10, 20, 30, 40, 50 g/l)실험을 실시한 결과 10 g/l에서 30.3 %로 신초발생율을 보였다. 이를 바탕으로 PLB의 갈변 억제에 효과적인 방법을 알아보기 위해 ascorbic acid (0, 50, 100, 150, 200 mg/l)와 activated charcoal (1 g/l)를 처리하였다. 생육과 갈변억제에 가장 효과적인 처리구를 알아보기 위한 실험으로 생육과 갈변을 8주간 관찰하였다. 갈변 억제는 ascorbic acid 200 mg/l에서 가장 효과적이었지만 생육은 ascorbic acid 150 mg/l에서 가장 빠른 것을 확인하였다. activated charcoal 1 g/l처리에서는 무처리구보다 갈변이 높은 것을 확인하여 activated charcoal의 갈변 억제 효과는 확인 할 수 없었다. 형질전환 실험에서는 Agrobacterium 매개 방법과 유전자 총을 이용한 실험을 실시하였다. 먼저 형질전환 시 BASTA를 이용하여 1차적 선발을 위해 비 형질전환체를 가지고 0.01, 0.05, 0.10, 0.15 % 처리한 기본 VW배지에 증식하여 관찰하였다. 실험을 실시한 결과 BASTA가 첨가되지 않은 대조구를 제외한 모든 처리구에서 개체들이 4주차에서 대부분이 고사하여 최적의 농도를 0.01 %로 선정하여 형질전환 선발을 진행하였다. Agrobacterium 접종 처리에서는 침봉처리 실험에서 (침봉, 무침봉) 무침봉처리가 1.87±0.75 %로 침봉처리보다 형질전환 효율이 높았으며, 균 OD600 농도 처리 (0.5, 1.0, 1.5, 2.0)에서는 OD600 0.5에서 13.19±4.01 %로 가장 높은 효율을 보였다. 접종시간 비교 실험 (5, 10, 20, 30분)에서는 30분에서만 1.18±0.50 %로 형질전환체를 확인하였으며, 유전자 총 실험에서는 이격거리 (3, 6, 9 cm) 실험을 실시한 결과 이격거리 6 cm에서 약 25 %, 삼투압 처리실험에서는 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol에서 20.7±1.5개의 PPT 저항성 PLB를 확인하였으며, bombardment 횟수 (1, 2, 3회)에 따른 형질전환 비교실험에서는 2회에서 10.3 ± 1.5개의 PPT 저항성 PLB를 확인하였다. 1차적으로 선발된 PLB를 이용하여 분자적인 분석을 한 결과 ORE7 gene (936 bp)을 확인할 수 있었다. 위의 형질전환 된 개체를 가지고 재 분화를 한 후 순화까지 완료된 발육이 좋은 몇 개체에서 꽃봉오리가 맺힌 후 정상적으로 개화를 하였다. 비형질전환체와 ORE7 유전자를 가진 개체간의 특이한 사항은 없었지만 꽃봉오리 개수가 ORE7 유전자를 가진 개체에서 4-5개 가량 더 많은 것을 확인하여 이는 유전자의 발현으로 인한 결과라고 사료된다. 위의 결과들을 가지고 팔레놉시스의 대량증식 체계 및 형질전환체 생산에 대한 체계에 도움이 되는 정보가 될 것이라 판단된다.
The purpose of this study is to establish the mass propagation system of Phalaenopsis and transformation system using Agrobacterium by using particle bombardment methods, and produce aging delay plants. In the experiments for establishing the mass propagation system, a ‘KNO21’ cultivar given by Kang...
The purpose of this study is to establish the mass propagation system of Phalaenopsis and transformation system using Agrobacterium by using particle bombardment methods, and produce aging delay plants. In the experiments for establishing the mass propagation system, a ‘KNO21’ cultivar given by Kangsan Farm is used as a plant material. When media type tests (VW, HCa, Knudson C, Orchimax) are performed, the regeneration efficiency on VW media is 74.0±2.2 %, which is the best. As the results of comparing PLB growth on a liquid or solid media, the shoot regeneration percentage on the solid media is 36.3%, which is higher than that on the liquid media by 1.7 %, but a significant difference is not observed. We examine the effects of various sucrose concentrations (0, 10, 20, 30, 40, 50 g/l) on PLB growth. As the results, the shoot regeneration percentage is 30.3 % on 10 g/l. Based on these results, we treat them with ascorbic acids (0, 50, 100, 150, 200 mg/l) and activated charcoal (1 g/l) in order to find an effective way to suppress browning of PLB. We observe growth and browning for 8 weeks as the experiment to find the most effective treatment group for growth and browning suppression. It is found that browning suppression is the most effective in ascorbic acid of 200 mg/l but growth is the fastest in ascorbic acid of 150 mg/l. Since it is found that browning is higher in the group treated with activated charcoal of 1 g/l than that in a control group, activated charcoal is not effective for browning suppression. We use an Agrobacterium-mediated method and a gene gun for transformation experiments. First, we observe the propagation of non-transformants on basic VW media treated with 0.01, 0.05, 0.10 and 0.15 % for the first screening when transformed with BASTA. As the results, most of cultivars are died in all treated groups except a control group without BASTA in the 4thweeks. Thus, we carry out the screening for transformation at 0.01 % as the optimal concentration. In groups treated with Agrobacterium, the transformation efficiency is 1.87±0.75 % in groups without needle holders and it is higher than that in groups treated with needle holders. When it is treated with bacterial OD600 concentration (0.5, 1.0, 1.5, 2.0), a group treated with OD600 of 0.5 shows the efficiency of 13.19±4.01 % which is the highest. We perform experiments to compare inoculation time (5, 10, 20, 30 minutes) and we find transformants with the efficiency of 1.18±0.50 % only in 30 minutes. We perform distance (3, 6, 9 cm) experiments using a gene gun, we find about 25 % in the distance of 6 cm. In the experiments treated with osmotic pressure, 20.7±1.5 of PPT resistant PLB is found in 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol. As the results of experiments to compare transformants depending on bombardment frequency (1, 2, 3 times), 10.3±1.5 of PPT resistant PLB is found in 2 times. As the results of molecular analysis using PLB selected as the first screening, we identify ORE7 gene (936 bp). In several transformants with excellent development where acclimation is completed after re-differentiation, they put out buds and these buds normally develop into flower. There is nothing significant between non-transformant and transformants containing ORE7 gene, but transformants containing ORE7 gene have more buds by 4-5 than non-transformants. It may be caused by the gene expression. Our results will be useful information to establish the mass propagation system of Phalaenopsis and transformation production system.
The purpose of this study is to establish the mass propagation system of Phalaenopsis and transformation system using Agrobacterium by using particle bombardment methods, and produce aging delay plants. In the experiments for establishing the mass propagation system, a ‘KNO21’ cultivar given by Kangsan Farm is used as a plant material. When media type tests (VW, HCa, Knudson C, Orchimax) are performed, the regeneration efficiency on VW media is 74.0±2.2 %, which is the best. As the results of comparing PLB growth on a liquid or solid media, the shoot regeneration percentage on the solid media is 36.3%, which is higher than that on the liquid media by 1.7 %, but a significant difference is not observed. We examine the effects of various sucrose concentrations (0, 10, 20, 30, 40, 50 g/l) on PLB growth. As the results, the shoot regeneration percentage is 30.3 % on 10 g/l. Based on these results, we treat them with ascorbic acids (0, 50, 100, 150, 200 mg/l) and activated charcoal (1 g/l) in order to find an effective way to suppress browning of PLB. We observe growth and browning for 8 weeks as the experiment to find the most effective treatment group for growth and browning suppression. It is found that browning suppression is the most effective in ascorbic acid of 200 mg/l but growth is the fastest in ascorbic acid of 150 mg/l. Since it is found that browning is higher in the group treated with activated charcoal of 1 g/l than that in a control group, activated charcoal is not effective for browning suppression. We use an Agrobacterium-mediated method and a gene gun for transformation experiments. First, we observe the propagation of non-transformants on basic VW media treated with 0.01, 0.05, 0.10 and 0.15 % for the first screening when transformed with BASTA. As the results, most of cultivars are died in all treated groups except a control group without BASTA in the 4thweeks. Thus, we carry out the screening for transformation at 0.01 % as the optimal concentration. In groups treated with Agrobacterium, the transformation efficiency is 1.87±0.75 % in groups without needle holders and it is higher than that in groups treated with needle holders. When it is treated with bacterial OD600 concentration (0.5, 1.0, 1.5, 2.0), a group treated with OD600 of 0.5 shows the efficiency of 13.19±4.01 % which is the highest. We perform experiments to compare inoculation time (5, 10, 20, 30 minutes) and we find transformants with the efficiency of 1.18±0.50 % only in 30 minutes. We perform distance (3, 6, 9 cm) experiments using a gene gun, we find about 25 % in the distance of 6 cm. In the experiments treated with osmotic pressure, 20.7±1.5 of PPT resistant PLB is found in 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol. As the results of experiments to compare transformants depending on bombardment frequency (1, 2, 3 times), 10.3±1.5 of PPT resistant PLB is found in 2 times. As the results of molecular analysis using PLB selected as the first screening, we identify ORE7 gene (936 bp). In several transformants with excellent development where acclimation is completed after re-differentiation, they put out buds and these buds normally develop into flower. There is nothing significant between non-transformant and transformants containing ORE7 gene, but transformants containing ORE7 gene have more buds by 4-5 than non-transformants. It may be caused by the gene expression. Our results will be useful information to establish the mass propagation system of Phalaenopsis and transformation production system.
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