Identification of porcine deltacoronavirus (PDCoV) and functional characterization of PDCoV nucleocapsid protein : 국내 돼지델타코로나바이러스 확인 및 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 기능학적 특성에 대한 연구원문보기
돼지 델타코로나바이러스(PDCoV)는 2012년 중국 홍콩에서 처음 발견된 신종 코로나바이러스이며 자돈에 있어 장염과 설사를 유발하는 바이러스이다. 이후 2014년 2월 미국 오하이오 주에서 발견되었고 계속해서 17개주 이상에서 바이러스 양성이 보고되고 있다.
PDCoV는 rotavirus나 porcine epidemicdiarrhea virus (PEDV)와 같은 다른 장내 병원성 바이러스와 함께 복합감염 상태로 검출되는 경우가 많지만 신생자돈에 접종 실험 결과 다른 바이러스와의 복합 감염이 없더라도 바이러스 단독 감염으로 심각한 ...
돼지 델타코로나바이러스(PDCoV)는 2012년 중국 홍콩에서 처음 발견된 신종 코로나바이러스이며 자돈에 있어 장염과 설사를 유발하는 바이러스이다. 이후 2014년 2월 미국 오하이오 주에서 발견되었고 계속해서 17개주 이상에서 바이러스 양성이 보고되고 있다.
PDCoV는 rotavirus나 porcine epidemicdiarrhea virus (PEDV)와 같은 다른 장내 병원성 바이러스와 함께 복합감염 상태로 검출되는 경우가 많지만 신생자돈에 접종 실험 결과 다른 바이러스와의 복합 감염이 없더라도 바이러스 단독 감염으로 심각한 융모 위축을 포함한 장 병변과 설사 등의 특이적인 임상 증상들을 확인하였다.
PDCoV는 약 25kb의 양성 단일가닥 RNA를 유전체로 가지며, Nidovirales 목(order), Coronaviridae 과(family), Deltacoronavirus 속(genus)에 속한다. PDCoV는 Alphacoronavirus의 PEDV, transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine respiratory coronavirus (PRCV), 그리고 Betacoronavirus의 porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (PHEV)와 함께 돼지에서 확인된 다섯 번째 코로나바이러스이다.
PDCoV의 유전체는 5′ untranslated region (UTR)부터 ORF1a, ORF1b, spike (S), envelope (E), membrane (M), NS (nonstructural protein)6, nucleocapsid (N), NS7과 폴리아데닐화된 말단인 3′ UTR으로 구성되어져있다. ORF1a와 ORF1b는 pp1a와 pp1ab라는 폴리단백질로 번역되어 적어도 15개 비구조단백질로 나누어지게 된다. 나머지 3′-말단에 위치한 ORF는 각각 subgenomic mRNA의 형태로 전사된 후 번역되어 구조단백질인 S, E, M, N 그리고 비구조단백질인 NS6, NS7을 생성한다.
PDCoV가 홍콩에서 발견된 이후 국내에 해당 바이러스가 존재하는지 확인하기 위해 델타코로나바이러스의 항원 검출 결과, 최근 국내 최초로 돼지 분변샘플에서 돼지델타코로나바이러스를 확인하였고 차세대 염기서열 분석을 통하여 전체 염기서열을 확인하였다. 염기서열 분석을 바탕으로 한 계통수 분석 및 염기서열간의 상동성 비교를 통하여 PDCoV 국내주는 홍콩주 보다는 미국주와 더 유사성이 있는 것을 확인하였다.
PDCoV는 세포배양의 어려움 때문에 바이러스-숙주 간의 상호작용에 대한 이해와 연구에 어려움이 있다. PDCoV는 다른 코로나바이러스와 마찬가지로 S, E, M, N과 같이 4개의 주요한 구조단백질을 가지게 되는데 이중 N 단백질은 바이러스 감염 시 숙주 세포 내에 가장 많이 존재하는 구조단백질이며 바이러스 복제 시 다양한 기능을 수행한다. 본 연구에서는 PDCoV의 이해를 위해 PDCoV의 N 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하여 숙주세포의 N 단백질의 발현에 따른 숙주세포에서의 기능적인 특징과 숙주세포의 단백질 발현 변화를 관찰하였다.
우선 cross-linking 실험을 통하여 PDCoV N 단백질은 비공유결합을 통해 연결된 올리고머를 형성하여 바이러스 캡시드 조립에 기여하는 것을 알 수 있었다. 또한, 형광항체법을 통해 PDCoV N 단백질이 주로 세포 핵 속의 인에 위치하고 있는 것을 확인하였다.
또한 시간대별로 변화하는 PK cell의 단백질 변화를 프로테오믹스 분석을 통하여 알아내었다. 그 결과, PK-PDCoV-N cell과 control PK cell에서 다른 발현량을 보이는 총 43개의 단백질 spot을 선별하였다. 이 중 통계적으로 유의성 있는 변화량을 보여주는 10개의 단백질 spot 중에서 8개의 단백질이 up-regulation 발현양상과 2개의 단백질이 down-regulation 발현양상을 나타냈다. 앞서 확인된 10개의 단백질은 각각 세포 분열, 대사 작용, stress response, 단백질 생합성, 수송 작용, 세포골격 네트워크와 세포 간 신호전달 등을 수행하는 단백질인 것을 확인하였다. 흥미롭게도, PK-PDCoV-N cell에서 2개의 heat shock protein 70 family protein이 up-regulation되었는데, heat shock 70-kDa protein 8 (HSC70) 단백질은 molecular chaperone으로 다양한 역할을 하며 바이러스 감염 시 숙주 세포로의 바이러스 entry 과정을 조절하며 비리온의 조립, 해체와 항바이러스 반응 및 apoptosis에 관여하는 단백질이다. 그리고 glucose-regulated protein 78 (GRP78) 단백질은 PDCoV의 N 단백질이 ER stress와 관련이 있다는 것을 보여주고 있다.
본 연구에서는 프로테오믹스 분석을 이용하여 PDCoV N 단백질의 숙주세포 내에서의 세포반응을 알아보았다. 이러한 프로테오믹스 분석 결과들로 PDCoV 감염 시 N 단백질의 기능적 특성을 규명할 수 있었다. 또한, PDCoV와 숙주세포의 상호작용 기전을 이해하는데 있어 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
돼지 델타코로나바이러스(PDCoV)는 2012년 중국 홍콩에서 처음 발견된 신종 코로나바이러스이며 자돈에 있어 장염과 설사를 유발하는 바이러스이다. 이후 2014년 2월 미국 오하이오 주에서 발견되었고 계속해서 17개주 이상에서 바이러스 양성이 보고되고 있다.
PDCoV는 rotavirus나 porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)와 같은 다른 장내 병원성 바이러스와 함께 복합감염 상태로 검출되는 경우가 많지만 신생자돈에 접종 실험 결과 다른 바이러스와의 복합 감염이 없더라도 바이러스 단독 감염으로 심각한 융모 위축을 포함한 장 병변과 설사 등의 특이적인 임상 증상들을 확인하였다.
PDCoV는 약 25kb의 양성 단일가닥 RNA를 유전체로 가지며, Nidovirales 목(order), Coronaviridae 과(family), Deltacoronavirus 속(genus)에 속한다. PDCoV는 Alphacoronavirus의 PEDV, transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine respiratory coronavirus (PRCV), 그리고 Betacoronavirus의 porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (PHEV)와 함께 돼지에서 확인된 다섯 번째 코로나바이러스이다.
PDCoV의 유전체는 5′ untranslated region (UTR)부터 ORF1a, ORF1b, spike (S), envelope (E), membrane (M), NS (nonstructural protein)6, nucleocapsid (N), NS7과 폴리아데닐화된 말단인 3′ UTR으로 구성되어져있다. ORF1a와 ORF1b는 pp1a와 pp1ab라는 폴리단백질로 번역되어 적어도 15개 비구조단백질로 나누어지게 된다. 나머지 3′-말단에 위치한 ORF는 각각 subgenomic mRNA의 형태로 전사된 후 번역되어 구조단백질인 S, E, M, N 그리고 비구조단백질인 NS6, NS7을 생성한다.
PDCoV가 홍콩에서 발견된 이후 국내에 해당 바이러스가 존재하는지 확인하기 위해 델타코로나바이러스의 항원 검출 결과, 최근 국내 최초로 돼지 분변샘플에서 돼지델타코로나바이러스를 확인하였고 차세대 염기서열 분석을 통하여 전체 염기서열을 확인하였다. 염기서열 분석을 바탕으로 한 계통수 분석 및 염기서열간의 상동성 비교를 통하여 PDCoV 국내주는 홍콩주 보다는 미국주와 더 유사성이 있는 것을 확인하였다.
PDCoV는 세포배양의 어려움 때문에 바이러스-숙주 간의 상호작용에 대한 이해와 연구에 어려움이 있다. PDCoV는 다른 코로나바이러스와 마찬가지로 S, E, M, N과 같이 4개의 주요한 구조단백질을 가지게 되는데 이중 N 단백질은 바이러스 감염 시 숙주 세포 내에 가장 많이 존재하는 구조단백질이며 바이러스 복제 시 다양한 기능을 수행한다. 본 연구에서는 PDCoV의 이해를 위해 PDCoV의 N 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하여 숙주세포의 N 단백질의 발현에 따른 숙주세포에서의 기능적인 특징과 숙주세포의 단백질 발현 변화를 관찰하였다.
우선 cross-linking 실험을 통하여 PDCoV N 단백질은 비공유결합을 통해 연결된 올리고머를 형성하여 바이러스 캡시드 조립에 기여하는 것을 알 수 있었다. 또한, 형광항체법을 통해 PDCoV N 단백질이 주로 세포 핵 속의 인에 위치하고 있는 것을 확인하였다.
또한 시간대별로 변화하는 PK cell의 단백질 변화를 프로테오믹스 분석을 통하여 알아내었다. 그 결과, PK-PDCoV-N cell과 control PK cell에서 다른 발현량을 보이는 총 43개의 단백질 spot을 선별하였다. 이 중 통계적으로 유의성 있는 변화량을 보여주는 10개의 단백질 spot 중에서 8개의 단백질이 up-regulation 발현양상과 2개의 단백질이 down-regulation 발현양상을 나타냈다. 앞서 확인된 10개의 단백질은 각각 세포 분열, 대사 작용, stress response, 단백질 생합성, 수송 작용, 세포골격 네트워크와 세포 간 신호전달 등을 수행하는 단백질인 것을 확인하였다. 흥미롭게도, PK-PDCoV-N cell에서 2개의 heat shock protein 70 family protein이 up-regulation되었는데, heat shock 70-kDa protein 8 (HSC70) 단백질은 molecular chaperone으로 다양한 역할을 하며 바이러스 감염 시 숙주 세포로의 바이러스 entry 과정을 조절하며 비리온의 조립, 해체와 항바이러스 반응 및 apoptosis에 관여하는 단백질이다. 그리고 glucose-regulated protein 78 (GRP78) 단백질은 PDCoV의 N 단백질이 ER stress와 관련이 있다는 것을 보여주고 있다.
본 연구에서는 프로테오믹스 분석을 이용하여 PDCoV N 단백질의 숙주세포 내에서의 세포반응을 알아보았다. 이러한 프로테오믹스 분석 결과들로 PDCoV 감염 시 N 단백질의 기능적 특성을 규명할 수 있었다. 또한, PDCoV와 숙주세포의 상호작용 기전을 이해하는데 있어 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
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