인삼의 주요 유효성분은 ginsenoside로 항암, 항면역, 항노화를 비롯한 항염증 그리고 신경세포 보호 등 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다. 특히 ginsenoside 들 중에 소량 성분 (minor ginsenoside)들은 다른 대량 성분들보다 더 적은 당 분자를 가지고 높은 약리활성을 보인다. 하지만 이런 소량성분들은 인삼자체에 극히 미량으로 존재해서 추출이 힘들다는 단점이 있다. 따라서, 본 연구에서는 이형 유전자인 β-glucosidase를 발현시킨 재조합 유산균(...
인삼의 주요 유효성분은 ginsenoside로 항암, 항면역, 항노화를 비롯한 항염증 그리고 신경세포 보호 등 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다. 특히 ginsenoside 들 중에 소량 성분 (minor ginsenoside)들은 다른 대량 성분들보다 더 적은 당 분자를 가지고 높은 약리활성을 보인다. 하지만 이런 소량성분들은 인삼자체에 극히 미량으로 존재해서 추출이 힘들다는 단점이 있다. 따라서, 본 연구에서는 이형 유전자인 β-glucosidase를 발현시킨 재조합 유산균(Lactococcus lactis)을 이용하여 다량 성분인 ginsenoside Rb1과 Rd를 미량 성분인 ginsenoside Rg3로 전환하는 연구를 수행하였다. 먼저 Flavobacterium johnsoniae UW101 유래의 BglBX10 유전자를 pNZ8008 플라스미드에 삽입하여 BglBX10 발현 플라스미드 pNZ-BglBX10을 구축하고 이를 L. lactis NZ9000에 형질전환하였다. 본 재조합 유산균을 GM17배지에서 배양하며 1ng/mL의 나이신(nisin)을 첨가하였을 때, 수용성 세포질에서 β-glucosidase 효소 활성이 검출되었고 나이신을 첨가하지 않은 대조구에 비해 약 3배정도의 발현율이 증가하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 정제된 단백질은 BglBX10 단백질에 해당하는 87.7 kDa의 분자량을 보였다. 인삼 추출물인 PPDGM을 기질로 이용하여 Rg3 전환 효율 조사하고자 세 가지 종류의 세포를 준비하였다. 먼저, 세포를 깨지 않은 상태의 whole cell은 44%의 전환률을 보였고, 초음파 파쇄기와 0.5% xylene을 이용해서 얻어진 세포 추출(cell lysates)과 천공세포(permeabilized cells)는 각각 58%와 61%의 전환률을 보였다. 본 연구에서 재조합 L. lactis를 이용한 BglBX10의 발현은 성공적이었으며, 유산균에서의 Rg3 생산성 증대 효과를 확인하였다. 본 연구에서 개발한 발현 시스템은 인삼의 건강 기능성을 향상시키는 데 장차 사용될 것으로 기대된다.
인삼의 주요 유효성분은 ginsenoside로 항암, 항면역, 항노화를 비롯한 항염증 그리고 신경세포 보호 등 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다. 특히 ginsenoside 들 중에 소량 성분 (minor ginsenoside)들은 다른 대량 성분들보다 더 적은 당 분자를 가지고 높은 약리활성을 보인다. 하지만 이런 소량성분들은 인삼자체에 극히 미량으로 존재해서 추출이 힘들다는 단점이 있다. 따라서, 본 연구에서는 이형 유전자인 β-glucosidase를 발현시킨 재조합 유산균(Lactococcus lactis)을 이용하여 다량 성분인 ginsenoside Rb1과 Rd를 미량 성분인 ginsenoside Rg3로 전환하는 연구를 수행하였다. 먼저 Flavobacterium johnsoniae UW101 유래의 BglBX10 유전자를 pNZ8008 플라스미드에 삽입하여 BglBX10 발현 플라스미드 pNZ-BglBX10을 구축하고 이를 L. lactis NZ9000에 형질전환하였다. 본 재조합 유산균을 GM17배지에서 배양하며 1ng/mL의 나이신(nisin)을 첨가하였을 때, 수용성 세포질에서 β-glucosidase 효소 활성이 검출되었고 나이신을 첨가하지 않은 대조구에 비해 약 3배정도의 발현율이 증가하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 정제된 단백질은 BglBX10 단백질에 해당하는 87.7 kDa의 분자량을 보였다. 인삼 추출물인 PPDGM을 기질로 이용하여 Rg3 전환 효율 조사하고자 세 가지 종류의 세포를 준비하였다. 먼저, 세포를 깨지 않은 상태의 whole cell은 44%의 전환률을 보였고, 초음파 파쇄기와 0.5% xylene을 이용해서 얻어진 세포 추출(cell lysates)과 천공세포(permeabilized cells)는 각각 58%와 61%의 전환률을 보였다. 본 연구에서 재조합 L. lactis를 이용한 BglBX10의 발현은 성공적이었으며, 유산균에서의 Rg3 생산성 증대 효과를 확인하였다. 본 연구에서 개발한 발현 시스템은 인삼의 건강 기능성을 향상시키는 데 장차 사용될 것으로 기대된다.
Ginsenosides are major active compounds of Panax ginseng. These compounds have various phamacological activities such as anti-stress, anti-tumour, anti-inflammatory, anti-aging, and neuro-protective activities. Ginsenosides are classified into two forms; the major form which is highly glycosylated a...
Ginsenosides are major active compounds of Panax ginseng. These compounds have various phamacological activities such as anti-stress, anti-tumour, anti-inflammatory, anti-aging, and neuro-protective activities. Ginsenosides are classified into two forms; the major form which is highly glycosylated and the minor form which has fewer sugar moieties. The minor ginsenosides are known to have higher activities than other major forms and they are difficult to extract from raw ginseng due to low amounts. Among them, the ginsenoside Rg3 leads attention of scientist because of it anti-metastasis and anti-tumour effects. Therefore, the aim of this study was to produce minor ginsenoside Rg3 from major forms, Rb1 and Rd, by using recombinant Lactococcus lactis expressing heterologous β-glucosidase gene. For this, the nucleotide sequence for β-glucosidase gene (BglBX10) from Flavobacterium johnsoniae UW101 was expressed in L. lactis NZ9000 by using pNZ8008 plasmid (pNZ-BglBX10). When L. lactis NZ9000 harboring pNZ-BglBX10 was cultivated in 100 mL GM17 medium and induced with nisin (1 ng/mL), β-glucosidase activities were detected in cytoplasmic fractions. The enzyme activities were 0.1 units/mL (uninduced) and 0.3 units/mL (induced). The specific β-glucosidase activities in the induced crude extract or purified fraction were 0.002 units/mg or 0.02 units/mg, respectively, showing 10-folds higher purification efficiency. SDS-PAGE analysis of the purified protein by Ni-NTA column gave a single band with a molecular weight of β-glucosidase (87.8 kDa). When the crude cell free extract was reacted with Rb1 and Rd, Rg3 was synthesized after hydrolysis of glucose residues at C-20 position of substrates. When the whole cells of L. lactis harboring pNZ-BglBX10 were reacted with protopanaxadiol type ginsenosides mixture (PPDGM) for 24 h, Rb1 and Rd were converted into Rg3 resulting in 44% of conversion yield. Meanwhile, when the harvested cells were lysated by sonication or permeabilized with 0.5% xylene, the conversion yield increased up to 58 % or 61%, respectively. This study demonstrates that the lysated or permeabilized L. lactis expressing β-glucosidase gene can be used to efficiently produce Rg3 compound in ginseng extract. The cell factory system that developed in this study will provide an alternative method to increase the health functions of Panax ginseng and development of ginseng industry.
Ginsenosides are major active compounds of Panax ginseng. These compounds have various phamacological activities such as anti-stress, anti-tumour, anti-inflammatory, anti-aging, and neuro-protective activities. Ginsenosides are classified into two forms; the major form which is highly glycosylated and the minor form which has fewer sugar moieties. The minor ginsenosides are known to have higher activities than other major forms and they are difficult to extract from raw ginseng due to low amounts. Among them, the ginsenoside Rg3 leads attention of scientist because of it anti-metastasis and anti-tumour effects. Therefore, the aim of this study was to produce minor ginsenoside Rg3 from major forms, Rb1 and Rd, by using recombinant Lactococcus lactis expressing heterologous β-glucosidase gene. For this, the nucleotide sequence for β-glucosidase gene (BglBX10) from Flavobacterium johnsoniae UW101 was expressed in L. lactis NZ9000 by using pNZ8008 plasmid (pNZ-BglBX10). When L. lactis NZ9000 harboring pNZ-BglBX10 was cultivated in 100 mL GM17 medium and induced with nisin (1 ng/mL), β-glucosidase activities were detected in cytoplasmic fractions. The enzyme activities were 0.1 units/mL (uninduced) and 0.3 units/mL (induced). The specific β-glucosidase activities in the induced crude extract or purified fraction were 0.002 units/mg or 0.02 units/mg, respectively, showing 10-folds higher purification efficiency. SDS-PAGE analysis of the purified protein by Ni-NTA column gave a single band with a molecular weight of β-glucosidase (87.8 kDa). When the crude cell free extract was reacted with Rb1 and Rd, Rg3 was synthesized after hydrolysis of glucose residues at C-20 position of substrates. When the whole cells of L. lactis harboring pNZ-BglBX10 were reacted with protopanaxadiol type ginsenosides mixture (PPDGM) for 24 h, Rb1 and Rd were converted into Rg3 resulting in 44% of conversion yield. Meanwhile, when the harvested cells were lysated by sonication or permeabilized with 0.5% xylene, the conversion yield increased up to 58 % or 61%, respectively. This study demonstrates that the lysated or permeabilized L. lactis expressing β-glucosidase gene can be used to efficiently produce Rg3 compound in ginseng extract. The cell factory system that developed in this study will provide an alternative method to increase the health functions of Panax ginseng and development of ginseng industry.
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