본 연구에서는 저칼로리 감미료로써 활용도가 높은 브라제인을 식품산업에서 많이 사용되는 효모 K. lactis 균주를 이용하여 발현 생산하는 과정에서 발현량이 증대되도록 하였으며, 다중 변이체를 작성하여 단맛에 관여하는 부위에 대한 연구와, 브라제인의 열 및 pH 안정성 연구를 통해 응용성을 확장시키고자 하였다. 4개의 ...
본 연구에서는 저칼로리 감미료로써 활용도가 높은 브라제인을 식품산업에서 많이 사용되는 효모 K. lactis 균주를 이용하여 발현 생산하는 과정에서 발현량이 증대되도록 하였으며, 다중 변이체를 작성하여 단맛에 관여하는 부위에 대한 연구와, 브라제인의 열 및 pH 안정성 연구를 통해 응용성을 확장시키고자 하였다. 4개의 이황화결합을 가지고 있는 브라제인의 발현량을 증대시키기 위하여 소포체에서 단백질 접힘과정이 원활하게 일어날 수 있도록 PDI를 과발현 시키고, DTT를 첨가하여 Ero1p를 유도하였다. 또한, 세포의 산화적스트레스를 감소시키기 위하여 L-ascorbic acid를 첨가하여 발현량을 증대시켰다. 이 세가지 요인을 복합적으로 적용한 결과 최대 6.3배의 발현량이 증가하였다. 또한, 다중 변이체의 N-말단을 알라닌으로 변이시킨 결과 단맛이 3배 증대 되었고, 41번 잔기를 리신으로 변이시켜 2배 증대 되었으며, C-말단 53번 잔기를 아르기닌으로 변이시킨 결과 2.8배 증대되었다. 이 부위들은 아미노산 크기와 전하에 의해 단맛 활성에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 효모 균주를 이용하여 발현 생산한 브라제인의 안정성 연구를 진행한 결과 야생형 브라제인과 변이체 브라제인 모두 80 ℃에서 4시간 반, 98 ℃에서 2시간 반 안정하며, pH 2에서 8.5까지 안정하여 식물유래 브라제인 단백질과 안정성이 같으며 저칼로리 감미료로 다방면 활용이 가능할 것으로 예상된다.
본 연구에서는 저칼로리 감미료로써 활용도가 높은 브라제인을 식품산업에서 많이 사용되는 효모 K. lactis 균주를 이용하여 발현 생산하는 과정에서 발현량이 증대되도록 하였으며, 다중 변이체를 작성하여 단맛에 관여하는 부위에 대한 연구와, 브라제인의 열 및 pH 안정성 연구를 통해 응용성을 확장시키고자 하였다. 4개의 이황화결합을 가지고 있는 브라제인의 발현량을 증대시키기 위하여 소포체에서 단백질 접힘과정이 원활하게 일어날 수 있도록 PDI를 과발현 시키고, DTT를 첨가하여 Ero1p를 유도하였다. 또한, 세포의 산화적스트레스를 감소시키기 위하여 L-ascorbic acid를 첨가하여 발현량을 증대시켰다. 이 세가지 요인을 복합적으로 적용한 결과 최대 6.3배의 발현량이 증가하였다. 또한, 다중 변이체의 N-말단을 알라닌으로 변이시킨 결과 단맛이 3배 증대 되었고, 41번 잔기를 리신으로 변이시켜 2배 증대 되었으며, C-말단 53번 잔기를 아르기닌으로 변이시킨 결과 2.8배 증대되었다. 이 부위들은 아미노산 크기와 전하에 의해 단맛 활성에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 효모 균주를 이용하여 발현 생산한 브라제인의 안정성 연구를 진행한 결과 야생형 브라제인과 변이체 브라제인 모두 80 ℃에서 4시간 반, 98 ℃에서 2시간 반 안정하며, pH 2에서 8.5까지 안정하여 식물유래 브라제인 단백질과 안정성이 같으며 저칼로리 감미료로 다방면 활용이 가능할 것으로 예상된다.
In this study, to extend the availability of application of brazzein to food chemistry as a low-calorie sweetener, brazzein expression level in the yeast K. lactis was significantly increased by integration of PDI genes into genomic DNA and addition of DTT and L-ascorbic acid into culture medium. In...
In this study, to extend the availability of application of brazzein to food chemistry as a low-calorie sweetener, brazzein expression level in the yeast K. lactis was significantly increased by integration of PDI genes into genomic DNA and addition of DTT and L-ascorbic acid into culture medium. In addition, not only studies for enhancing sweetness by site-directed mutagenesis based on multiply mutated brazzein variants but also studies on pH, thermal stability were performed. To improve protein folding of brazzein with four intracellular disulfide bonds in endoplasmic reticulum, PDI gene was over-expressed and expression of Ero1p was induced by addition of DTT. Moreover, to reduce oxidative stress within the cell, L-ascorbic acid was included in the culture medium resulting overall increasement of protein expression level up to 6.3 times. Furthermore, alanine addition at the N-terminus of brazzein resulted in increase of its sweetness with a factor of three as well as substitution of Glu41 to lysine and Glu53 to arginine resulted twice and 2.8 times stronger sweetness. This implies that size and charge of specific amino acids may affect the sweetness of brazzein. Lastly, it has been shown that both wild-type brazzein and its mutants exhibited thermostability of each 4.5 h, 2.5 h at 80 ℃ and 98 ℃ and pH stability in the range of 2~8.5 which are identical to that of plant-derived brazzein making it a possible promising low-calorie sweetener in the future.
In this study, to extend the availability of application of brazzein to food chemistry as a low-calorie sweetener, brazzein expression level in the yeast K. lactis was significantly increased by integration of PDI genes into genomic DNA and addition of DTT and L-ascorbic acid into culture medium. In addition, not only studies for enhancing sweetness by site-directed mutagenesis based on multiply mutated brazzein variants but also studies on pH, thermal stability were performed. To improve protein folding of brazzein with four intracellular disulfide bonds in endoplasmic reticulum, PDI gene was over-expressed and expression of Ero1p was induced by addition of DTT. Moreover, to reduce oxidative stress within the cell, L-ascorbic acid was included in the culture medium resulting overall increasement of protein expression level up to 6.3 times. Furthermore, alanine addition at the N-terminus of brazzein resulted in increase of its sweetness with a factor of three as well as substitution of Glu41 to lysine and Glu53 to arginine resulted twice and 2.8 times stronger sweetness. This implies that size and charge of specific amino acids may affect the sweetness of brazzein. Lastly, it has been shown that both wild-type brazzein and its mutants exhibited thermostability of each 4.5 h, 2.5 h at 80 ℃ and 98 ℃ and pH stability in the range of 2~8.5 which are identical to that of plant-derived brazzein making it a possible promising low-calorie sweetener in the future.
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