Anthrax toxin receptor 1 (ANTXR1)은 골의 형성 과정과 밀접한 연관성이 있는 세포외 기질 단백질과 상호작용하며 신생혈관의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 하지만, 조골세포와 파골세포에 의하여 조절되는 골대사 과정에 미치는 ANTXR1의 영향에 대한 연구는 전혀 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 조골세포와 파골세포 분화 및 기능에 미치는 ANTXR1의 역할과 ANTXR1의 골대사 조절 기전을 규명하고자 하였다. ANTXR1 유전자의 기능을 과발현 또는 억제하는 기법을 이용하여 in vitro 실험을 수행하였고, ANTXR1 유전자 결핍 마우스를 제작하여 ...
Anthrax toxin receptor 1 (ANTXR1)은 골의 형성 과정과 밀접한 연관성이 있는 세포외 기질 단백질과 상호작용하며 신생혈관의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 하지만, 조골세포와 파골세포에 의하여 조절되는 골대사 과정에 미치는 ANTXR1의 영향에 대한 연구는 전혀 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 조골세포와 파골세포 분화 및 기능에 미치는 ANTXR1의 역할과 ANTXR1의 골대사 조절 기전을 규명하고자 하였다. ANTXR1 유전자의 기능을 과발현 또는 억제하는 기법을 이용하여 in vitro 실험을 수행하였고, ANTXR1 유전자 결핍 마우스를 제작하여 생체 내 골대사에 미치는 영향을 증명하였다. 파골세포 분화를 위해 마우스의 골수유래 대식세포를 macrophage colony stimulating factor (M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)를 첨가하여 배양하였고, 조골세포 분화를 위해 마우스의 두개골에서 분리한 초대조골세포를 사용하였다. 파골세포의 분화는 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색과 filamentous actin (F-actin) 분석을 통해 확인하였고, 성숙한 파골세포의 골흡수 기능은 hydroxyapatite-coated plates와 dentin slices에서 증명하였다. 골대사를 조절하는 전사인자들의 발현과 신호전달경로는 실시간 중합효소연쇄반응과 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였고, ANTXR1 유전자 결핍 마우스의 골 특성은 micro-computed tomography (CT)와 조직학적 분석을 통해 확인하였다. In vitro 실험에서, ANTXR1은 조골세포의 분화와 기능에는 영향을 미치지 않았지만, RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화는 촉진시키고 골흡수능을 증가시킴을 확인하였다. ANTXR1의 과발현은 c-Fos와 nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1 (NFATc1)의 mRNA와 단백질을 모두 증가시켰으며, 초기 신호전달체인 c-jun N-terminal kinase (JNK), Akt 및 inhibitor of kappa B (IkB)의 인산화를 촉진하였다. 흥미롭게도 in vitro 실험과는 반대로 ANTXR1 유전자 결핍 마우스는 micro-CT와 조직학적 분석 결과 심각한 골 소실 현상이 확인 되었으며, ANTXR1 유전자 결핍 마우스에서 분리한 골수세포는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화가 야생형 마우스에 비해 더욱 증진되는 되었다. ANTXR1 유전자 결핍 마우스에서 c-Fos와 NFATc1의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되었고, phospholipase C gamma 2 (PLCg2)와 JNK의 인산화와 osteoclast-associated receptor (OSCAR), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), osteoclast stimulatory transmembrane protein (OC-STAMP), Atp6vod2와 Cathepsin K의 mRNA 발현을 유의성 있게 증가하였다. 이와 같이 in vitro와 in vivo의 상반된 결과가 확인됨에 따라 마우스 생체 내에서는 ANTXR1 유전자가 골대사를 조절하는데 다른 조직의 대사와 관련된 인자에 의해서 영향을 받을 수 있음을 제시하였다. 골수세포에 siANTXR1을 이용하여 유전자를 억제시킨 후 내피세포의 혈관 형성을 확인한 결과 대조군에 비해 억제되는데 반해, ATNXR1 유전자 결핍 마우스에 분리된 골수세포를 이용한 혈관 형성은 야생형 마우스에 비해 유의하게 증가되었다. 또한 중족골 체외 배양 실험 결과, RANKL처리 시 증가되는 신생혈관형성이 ANTXR1 재조합단백질을 함께 처리하게 되면 억제되는 것을 확인하였다. 이는 ANTXR1이 matrix metalloprote- inase-9 (MMP-9)과 vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A)의 발현을 세포 내에서와 생체 내에서 다르게 조절함에 의해 유도됨을 확인함으로써 부분적으로 설명할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 ANTXR1이 파골세포의 분화와 기능을 조절하는데 중요한 역할을 수행하며, 생체 내에서 ANTXR1에 의해 조절되는 골대사에 혈관형성과 관련된 인자들이 부분적으로 중요한 매개체로써 작용할 수 있음을 제시하였다. 따라서, 본 연구를 통해 ANTXR1이 골 질환 관련 유전자 치료의 후보물질로써 가능성이 있음을 증명하였고, 더 나아가 혈관형성과 깊은 연관성이 있는 골 전이 연구 및 골 재생/의공학 분야에도 중요한 단서를 제공할 수 있을 것으로 예상된다.
Anthrax toxin receptor 1 (ANTXR1)은 골의 형성 과정과 밀접한 연관성이 있는 세포외 기질 단백질과 상호작용하며 신생혈관의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 하지만, 조골세포와 파골세포에 의하여 조절되는 골대사 과정에 미치는 ANTXR1의 영향에 대한 연구는 전혀 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 조골세포와 파골세포 분화 및 기능에 미치는 ANTXR1의 역할과 ANTXR1의 골대사 조절 기전을 규명하고자 하였다. ANTXR1 유전자의 기능을 과발현 또는 억제하는 기법을 이용하여 in vitro 실험을 수행하였고, ANTXR1 유전자 결핍 마우스를 제작하여 생체 내 골대사에 미치는 영향을 증명하였다. 파골세포 분화를 위해 마우스의 골수유래 대식세포를 macrophage colony stimulating factor (M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)를 첨가하여 배양하였고, 조골세포 분화를 위해 마우스의 두개골에서 분리한 초대조골세포를 사용하였다. 파골세포의 분화는 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색과 filamentous actin (F-actin) 분석을 통해 확인하였고, 성숙한 파골세포의 골흡수 기능은 hydroxyapatite-coated plates와 dentin slices에서 증명하였다. 골대사를 조절하는 전사인자들의 발현과 신호전달경로는 실시간 중합효소연쇄반응과 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였고, ANTXR1 유전자 결핍 마우스의 골 특성은 micro-computed tomography (CT)와 조직학적 분석을 통해 확인하였다. In vitro 실험에서, ANTXR1은 조골세포의 분화와 기능에는 영향을 미치지 않았지만, RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화는 촉진시키고 골흡수능을 증가시킴을 확인하였다. ANTXR1의 과발현은 c-Fos와 nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1 (NFATc1)의 mRNA와 단백질을 모두 증가시켰으며, 초기 신호전달체인 c-jun N-terminal kinase (JNK), Akt 및 inhibitor of kappa B (IkB)의 인산화를 촉진하였다. 흥미롭게도 in vitro 실험과는 반대로 ANTXR1 유전자 결핍 마우스는 micro-CT와 조직학적 분석 결과 심각한 골 소실 현상이 확인 되었으며, ANTXR1 유전자 결핍 마우스에서 분리한 골수세포는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화가 야생형 마우스에 비해 더욱 증진되는 되었다. ANTXR1 유전자 결핍 마우스에서 c-Fos와 NFATc1의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되었고, phospholipase C gamma 2 (PLCg2)와 JNK의 인산화와 osteoclast-associated receptor (OSCAR), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), osteoclast stimulatory transmembrane protein (OC-STAMP), Atp6vod2와 Cathepsin K의 mRNA 발현을 유의성 있게 증가하였다. 이와 같이 in vitro와 in vivo의 상반된 결과가 확인됨에 따라 마우스 생체 내에서는 ANTXR1 유전자가 골대사를 조절하는데 다른 조직의 대사와 관련된 인자에 의해서 영향을 받을 수 있음을 제시하였다. 골수세포에 siANTXR1을 이용하여 유전자를 억제시킨 후 내피세포의 혈관 형성을 확인한 결과 대조군에 비해 억제되는데 반해, ATNXR1 유전자 결핍 마우스에 분리된 골수세포를 이용한 혈관 형성은 야생형 마우스에 비해 유의하게 증가되었다. 또한 중족골 체외 배양 실험 결과, RANKL처리 시 증가되는 신생혈관형성이 ANTXR1 재조합단백질을 함께 처리하게 되면 억제되는 것을 확인하였다. 이는 ANTXR1이 matrix metalloprote- inase-9 (MMP-9)과 vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A)의 발현을 세포 내에서와 생체 내에서 다르게 조절함에 의해 유도됨을 확인함으로써 부분적으로 설명할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 ANTXR1이 파골세포의 분화와 기능을 조절하는데 중요한 역할을 수행하며, 생체 내에서 ANTXR1에 의해 조절되는 골대사에 혈관형성과 관련된 인자들이 부분적으로 중요한 매개체로써 작용할 수 있음을 제시하였다. 따라서, 본 연구를 통해 ANTXR1이 골 질환 관련 유전자 치료의 후보물질로써 가능성이 있음을 증명하였고, 더 나아가 혈관형성과 깊은 연관성이 있는 골 전이 연구 및 골 재생/의공학 분야에도 중요한 단서를 제공할 수 있을 것으로 예상된다.
Ⅰ. Introduction 7 Ⅱ. Materials and methods 13 1. Reagents and antibodies 13 2. Wild-type and ANTXR1 knockout C57BL/6 mice 13 3. Ethics statement 14 4. Experimental animals 15 5. In vitro osteoclastogenesis assay 15 6. Osteoblastic cell culture and analysis 16 7. Osteo...
Ⅰ. Introduction 7 Ⅱ. Materials and methods 13 1. Reagents and antibodies 13 2. Wild-type and ANTXR1 knockout C57BL/6 mice 13 3. Ethics statement 14 4. Experimental animals 15 5. In vitro osteoclastogenesis assay 15 6. Osteoblastic cell culture and analysis 16 7. Osteoclastogenesis assay from co-culture system of BMCs and prima- ry calvaria osteoblasts 17 8. Retrovirus preparation and infection 17 9. siRNA transfection 18 10. Actin ring formation assay 19 11. Survival and resorption pit formation assay 19 12. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 20 13. Western blot analysis 21 14. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 21 15. Immunofluorescence confocal microscopy 22 16. Fetal mouse metatarsal angiogenesis assay 22 17. Histological analysis 23 18. Micro-computed tomography (CT) analysis 23 19. Statistical analysis 24 Ⅲ. Results 25 1.ANTXR1 is expressed in various tissues from BALB/c and C57BL/6 mouse and detected in membrane of BMMs, osteoclasts, and osteoblasts 25 2.The expression of ANTXR1 is induced during osteoclastogenesis and osteogenesis 25 3.Overexpression of ANTXR1 promotes RANKL-mediated osteoclast differentiation and bone resorption 26 4.Overexpression of ANTXR1 enhances the expression of c-Fos and NFATc1 via phosphorylation of JNK, Akt, and IkB 27 5.Knockdown of ANTXR1 reversely inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption 27 6.Knockdown of ANTXR1 impedes the expression level of c-Fos and NFATc1 through de-phosphorylating JNK, Akt, and IkB 28 7.ANTXR1 is not related with osteoblast differentiation and the secretion of OPG and RANKL from osteoblasts 29 8.Wild-type and ANTXR1 knockout mice display similar appearance in both male and female gender 30 9.ANTXR1 knockout mice show a low bone mass phenotype compared with wild-type mice 30 10.Serum level of CTX-1 is higher in ANTXR1 knockout mice than wild-type mice 31 11.ANTXR1 knockout BMMs show enhanced osteoclast differentiation compared with wild-type BMMs 32 12.The mRNA and protein level of c-Fos and NFATc1 is elevated in ANTXR1 knockout BMMs via increasing phosphorylation of PLCg2 and JNK 32 13.Expression of osteoclast-specific marker genes is up-regulated in BMMs from ANTXR1 knockout mice upon RANKL stimulation 33 14. Genetic manipulation of ANTXR1 in BMMs regulates HUVECs-me -diated angiogenesis 33 15. The effect of ANTXR1 on osteoclast-induced angiogenesis is achie- ved by regulation of MMP-9 and VEGF-A 34 Ⅳ. Discussion 36 Ⅴ. Conclusion 43
Ⅰ. Introduction 7 Ⅱ. Materials and methods 13 1. Reagents and antibodies 13 2. Wild-type and ANTXR1 knockout C57BL/6 mice 13 3. Ethics statement 14 4. Experimental animals 15 5. In vitro osteoclastogenesis assay 15 6. Osteoblastic cell culture and analysis 16 7. Osteoclastogenesis assay from co-culture system of BMCs and prima- ry calvaria osteoblasts 17 8. Retrovirus preparation and infection 17 9. siRNA transfection 18 10. Actin ring formation assay 19 11. Survival and resorption pit formation assay 19 12. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 20 13. Western blot analysis 21 14. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 21 15. Immunofluorescence confocal microscopy 22 16. Fetal mouse metatarsal angiogenesis assay 22 17. Histological analysis 23 18. Micro-computed tomography (CT) analysis 23 19. Statistical analysis 24 Ⅲ. Results 25 1.ANTXR1 is expressed in various tissues from BALB/c and C57BL/6 mouse and detected in membrane of BMMs, osteoclasts, and osteoblasts 25 2.The expression of ANTXR1 is induced during osteoclastogenesis and osteogenesis 25 3.Overexpression of ANTXR1 promotes RANKL-mediated osteoclast differentiation and bone resorption 26 4.Overexpression of ANTXR1 enhances the expression of c-Fos and NFATc1 via phosphorylation of JNK, Akt, and IkB 27 5.Knockdown of ANTXR1 reversely inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption 27 6.Knockdown of ANTXR1 impedes the expression level of c-Fos and NFATc1 through de-phosphorylating JNK, Akt, and IkB 28 7.ANTXR1 is not related with osteoblast differentiation and the secretion of OPG and RANKL from osteoblasts 29 8.Wild-type and ANTXR1 knockout mice display similar appearance in both male and female gender 30 9.ANTXR1 knockout mice show a low bone mass phenotype compared with wild-type mice 30 10.Serum level of CTX-1 is higher in ANTXR1 knockout mice than wild-type mice 31 11.ANTXR1 knockout BMMs show enhanced osteoclast differentiation compared with wild-type BMMs 32 12.The mRNA and protein level of c-Fos and NFATc1 is elevated in ANTXR1 knockout BMMs via increasing phosphorylation of PLCg2 and JNK 32 13.Expression of osteoclast-specific marker genes is up-regulated in BMMs from ANTXR1 knockout mice upon RANKL stimulation 33 14. Genetic manipulation of ANTXR1 in BMMs regulates HUVECs-me -diated angiogenesis 33 15. The effect of ANTXR1 on osteoclast-induced angiogenesis is achie- ved by regulation of MMP-9 and VEGF-A 34 Ⅳ. Discussion 36 Ⅴ. Conclusion 43
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