페니실린 비감수성 Streptococcus agalactiae 유전체 분석을 통한 내성기전 및 역학 조사 Genomic analysis of penicillin-nonsusceptible Streptococcus agalactiae for investigation of the resistance mechanism and the epidemiology원문보기
연구 목적 Streptococcus agalactiae 는 베타용혈상을 보이는 Lancefield B 형 화농성 연쇄상구균으로 여성의 질에 상재균으로 존재하지만, 산모의 산욕열, 신생아 뇌수막염, 패혈증 같은 심각한 감염의 원인이 된다. 성인에서는 ...
연구 목적 Streptococcus agalactiae 는 베타용혈상을 보이는 Lancefield B 형 화농성 연쇄상구균으로 여성의 질에 상재균으로 존재하지만, 산모의 산욕열, 신생아 뇌수막염, 패혈증 같은 심각한 감염의 원인이 된다. 성인에서는 지역사회 획득 요로감염, 고령의 노인이나 면역저하 입원환자에게 원내획득 폐렴, 패혈증 등을 일으킬 수 있다. 현재까지 S. agalactiae는 일차 약제인 페니실린에 대한 내성이 보고된 적이 없어서 S. agalactiae감염시 페니실린에 대한 항균제감수성 검사는 일차적으로 권장하지 않으며, 항균제감수성검사 판독에 감수성 기준만을 가지고 있다. 페니실린 비감수성 S. agalactiae (PNSA) 3주를 분리하여 유전형적, 표현형적 특성을 분석하고, 페니실린 비감수성의 기전을 규명하고자 하였다. 이를 위해 세 주의 균종 동정, 항균제감수성검사, 분자형별검사, 페니실린 결합단백(Penicillin-binding protein; PBP) 유전자 분석, 전장유전체분석과 RNA 발현분석을 시행하였다.
연구 방법 균종동정은 Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)로 MALDI-TOF 분석과 Lancefield 혈청형검사로 확인하였고, 항균제감수성검사는 Microscan® STREP MSP6+ panel (Beckman Coulter, West Sacramento, CA, USA)를 사용하여 16 종류의 항균제를 검사하였고, 페니실린에 대한 최소억제농도(MIC)는 Etest (BioMerieux, Solna, Sweden)로 검사하였다. 분자형별검사는 S. agalactiae에 대한 다좌염기서열 타이핑(multi-locus sequence typing) 프로토콜에 따라 실시하였다. PBP 유전자 pbp1a, pbp2b, pbp2x에 대해 3쌍의 시발체로 중합효소연쇄반응 산물을 얻어서 Sanger 법으로 염기서열분석을 하였다. 전장유전체는 PacBio 20-kb platform (Pacifc Biosciences, USA)을 이용하여 실시하였다. 전장 유전체로부터 (Virulence factors of pathogenic bacteria) [http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.ht], ResFinder-3.1 [https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/], CARD-RGI (Comprehensive antibiotic resistance database- resistance gene identifier) [https://card.mcmaster.ca/], ARTS (Antibiotic resistance target seeker) [http://www.umd.be/HSF3/HSF.html] 프로그램을 이용해서 항균제내성 유전자와 병원성유전자를 검색하였고 염기서열을 이용한 serotyping을 시행하였다. S. agalactiae 2603V/R 의 PBP1a, PBP2b, PBP2x 를 참고 염기서열로 하여 PBP에 대한 단일유전좌 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 을 확인하였다. 전장 유전체가 공개되어 있는 페니실린 감수성 Streptococcus agalactiae 16주와 비교분석하였다. RNA 발현 정도의 비교는 S. agalactiae ATCC13813을 참고주로 하여 세 주의 RNA를 정량분석하여 분석하였다.
결과 2016-18년 사이 4개월, 13개월 간격으로 76세 여자, 94세 여자, 80세 여자환자의 객담 검체에서 3주가 분리되었다. 한 명은 알츠하이머 치매로 요양병원에서 지내던 환자이고 두 명은 간질성 폐질환과 폐 전이를 동반한 갑상선암으로 집에서 요양중인 상태였다. MALDI-TOF 에서 S. agalactiae 로 동정되었고, Lancefield group B 형으로 타이핑 되었다. Ampicillin, chloramphenicol, ceftriaxone, cefotaxime, daptomycin, linezolid, meropenem, vancomycin에 감수성이었고 azithromycin, clindamycin, clarithromycin, erythromycin, levofloxacin, minocycline, tetracycline에 내성이었다. Penicillin 에 대한 MIC는 각각 0.19 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml이었다. 세 주 모두 MLST 분석 상 동일하게 ST10이었다. PBP 유전자 분석에서 세 주에서 공통적으로 pbp2x에 G398A, V405A, Q557E 치환이 있음이 발견되었다. 전장 유전체는 각각 2,445,137 bp, 2,528,754 bp, 2,486,170 bp 였고 1개, 2개, 1개의 컨티그(contig)로 구성되었다. 코드화 염기서열(coding sequence)는 각각 2,401개, 2,438/54개, 2,485개였으며 G+C%는 35.74, 35.57/36.33, 35.90이었다. 항균제 내성 유전자로 세 주 모두 PBP 유전자 돌연변이와 함께 ermB 와 tetM를 보유하였다. 병독인자로 부착과 항탐식작용 등에 관련된 유전자를 보유하였으며 세 주 모두 동일한 양상을 보였고 세 주 모두 serotype VI이고, ST10으로 국내 보고가 드문 형이었다. 16주의 참고주와 전장유전체를 비교하였을 때 최소 5,282개에서 최대 19,229개에 이르는 SNP를 확인하였으며, 세 시험주가 동시에 보유하고 있는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation) 는 170개로 총 95개의 코딩 부위에서 확인되었다. 세 주를 각각 참고주로 하여 시험주들 사이에 유전체를 비교했을 때 SNP 차이가 214-603개에 불과하였다. RNA 분석에서는 참고주인 S. agalactiae ATCC13813에 비해 RNA 발현이 감소한 유전자가 247개, 증가한 유전자가 69개였다. 참고주에 비해 RNA 표현에 유의한 차이가 있는 유전자는 11개였는데 bca, lmrB, bcrA는 발현이 유의하게 낮았고 cfb, cpsL, dhdh, dppA, lrgA2, neuC, pdxH, pflA는 발현이 높은 유전자였다. 따라서 세 PNSA 병독성 인자로 neuC 발현 증진에 의한 캡슐 형성이 향상되어 있을 것으로 추정된다.
고찰 및 결론 페니실린 비감수성 S. agalactiae 의 ST10형의 클론이 지역사회 획득성으로 역학적인 연관성이 없는 환자들에서 분리되면서 특정한 다제내성 S. agalactiae 클론이 지역사회에 확산되었을 것으로 추정된다. 이전 국내 보고 증례 2예와 마찬가지로 고령이나 요양병원 거주 등이 위험인자일 것으로 추정된다. 페니실린 비감수성은 PBP 유전자 RNA의 양적인 변화와는 관련이 없었다. 세 주에서 공통적인PBP2x의 점돌연변이가 발견되어 기존에 보고된 페니실린 결합 단백의 돌연변이가 페니실린 비감수성 S. agalactiae의 내성 기전임을 확인하였다. 이들 환자에서 페니실린을 비롯한 항균제 사용력이 없다는 점에서 항균제 사용에 의해 돌연변이를 획득하기보다는 클론성 전파가 페니실린 비감수성 S. agalactiae 출현의 원인으로 판단된다. 국내 임상미생물검사실에서는 S. agalactiae 임상분리주에 대한 항균제 감수성검사를 실시하고 내성율에 대한 결과를 지속적으로 감시 관찰할 것이 요구된다.
연구 목적 Streptococcus agalactiae 는 베타용혈상을 보이는 Lancefield B 형 화농성 연쇄상구균으로 여성의 질에 상재균으로 존재하지만, 산모의 산욕열, 신생아 뇌수막염, 패혈증 같은 심각한 감염의 원인이 된다. 성인에서는 지역사회 획득 요로감염, 고령의 노인이나 면역저하 입원환자에게 원내획득 폐렴, 패혈증 등을 일으킬 수 있다. 현재까지 S. agalactiae는 일차 약제인 페니실린에 대한 내성이 보고된 적이 없어서 S. agalactiae감염시 페니실린에 대한 항균제감수성 검사는 일차적으로 권장하지 않으며, 항균제감수성검사 판독에 감수성 기준만을 가지고 있다. 페니실린 비감수성 S. agalactiae (PNSA) 3주를 분리하여 유전형적, 표현형적 특성을 분석하고, 페니실린 비감수성의 기전을 규명하고자 하였다. 이를 위해 세 주의 균종 동정, 항균제감수성검사, 분자형별검사, 페니실린 결합단백(Penicillin-binding protein; PBP) 유전자 분석, 전장유전체분석과 RNA 발현분석을 시행하였다.
연구 방법 균종동정은 Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)로 MALDI-TOF 분석과 Lancefield 혈청형검사로 확인하였고, 항균제감수성검사는 Microscan® STREP MSP6+ panel (Beckman Coulter, West Sacramento, CA, USA)를 사용하여 16 종류의 항균제를 검사하였고, 페니실린에 대한 최소억제농도(MIC)는 Etest (BioMerieux, Solna, Sweden)로 검사하였다. 분자형별검사는 S. agalactiae에 대한 다좌염기서열 타이핑(multi-locus sequence typing) 프로토콜에 따라 실시하였다. PBP 유전자 pbp1a, pbp2b, pbp2x에 대해 3쌍의 시발체로 중합효소연쇄반응 산물을 얻어서 Sanger 법으로 염기서열분석을 하였다. 전장유전체는 PacBio 20-kb platform (Pacifc Biosciences, USA)을 이용하여 실시하였다. 전장 유전체로부터 (Virulence factors of pathogenic bacteria) [http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.ht], ResFinder-3.1 [https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/], CARD-RGI (Comprehensive antibiotic resistance database- resistance gene identifier) [https://card.mcmaster.ca/], ARTS (Antibiotic resistance target seeker) [http://www.umd.be/HSF3/HSF.html] 프로그램을 이용해서 항균제내성 유전자와 병원성유전자를 검색하였고 염기서열을 이용한 serotyping을 시행하였다. S. agalactiae 2603V/R 의 PBP1a, PBP2b, PBP2x 를 참고 염기서열로 하여 PBP에 대한 단일유전좌 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 을 확인하였다. 전장 유전체가 공개되어 있는 페니실린 감수성 Streptococcus agalactiae 16주와 비교분석하였다. RNA 발현 정도의 비교는 S. agalactiae ATCC13813을 참고주로 하여 세 주의 RNA를 정량분석하여 분석하였다.
결과 2016-18년 사이 4개월, 13개월 간격으로 76세 여자, 94세 여자, 80세 여자환자의 객담 검체에서 3주가 분리되었다. 한 명은 알츠하이머 치매로 요양병원에서 지내던 환자이고 두 명은 간질성 폐질환과 폐 전이를 동반한 갑상선암으로 집에서 요양중인 상태였다. MALDI-TOF 에서 S. agalactiae 로 동정되었고, Lancefield group B 형으로 타이핑 되었다. Ampicillin, chloramphenicol, ceftriaxone, cefotaxime, daptomycin, linezolid, meropenem, vancomycin에 감수성이었고 azithromycin, clindamycin, clarithromycin, erythromycin, levofloxacin, minocycline, tetracycline에 내성이었다. Penicillin 에 대한 MIC는 각각 0.19 µg/ml, 0.5 µg/ml, 0.25 µg/ml이었다. 세 주 모두 MLST 분석 상 동일하게 ST10이었다. PBP 유전자 분석에서 세 주에서 공통적으로 pbp2x에 G398A, V405A, Q557E 치환이 있음이 발견되었다. 전장 유전체는 각각 2,445,137 bp, 2,528,754 bp, 2,486,170 bp 였고 1개, 2개, 1개의 컨티그(contig)로 구성되었다. 코드화 염기서열(coding sequence)는 각각 2,401개, 2,438/54개, 2,485개였으며 G+C%는 35.74, 35.57/36.33, 35.90이었다. 항균제 내성 유전자로 세 주 모두 PBP 유전자 돌연변이와 함께 ermB 와 tetM를 보유하였다. 병독인자로 부착과 항탐식작용 등에 관련된 유전자를 보유하였으며 세 주 모두 동일한 양상을 보였고 세 주 모두 serotype VI이고, ST10으로 국내 보고가 드문 형이었다. 16주의 참고주와 전장유전체를 비교하였을 때 최소 5,282개에서 최대 19,229개에 이르는 SNP를 확인하였으며, 세 시험주가 동시에 보유하고 있는 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation) 는 170개로 총 95개의 코딩 부위에서 확인되었다. 세 주를 각각 참고주로 하여 시험주들 사이에 유전체를 비교했을 때 SNP 차이가 214-603개에 불과하였다. RNA 분석에서는 참고주인 S. agalactiae ATCC13813에 비해 RNA 발현이 감소한 유전자가 247개, 증가한 유전자가 69개였다. 참고주에 비해 RNA 표현에 유의한 차이가 있는 유전자는 11개였는데 bca, lmrB, bcrA는 발현이 유의하게 낮았고 cfb, cpsL, dhdh, dppA, lrgA2, neuC, pdxH, pflA는 발현이 높은 유전자였다. 따라서 세 PNSA 병독성 인자로 neuC 발현 증진에 의한 캡슐 형성이 향상되어 있을 것으로 추정된다.
고찰 및 결론 페니실린 비감수성 S. agalactiae 의 ST10형의 클론이 지역사회 획득성으로 역학적인 연관성이 없는 환자들에서 분리되면서 특정한 다제내성 S. agalactiae 클론이 지역사회에 확산되었을 것으로 추정된다. 이전 국내 보고 증례 2예와 마찬가지로 고령이나 요양병원 거주 등이 위험인자일 것으로 추정된다. 페니실린 비감수성은 PBP 유전자 RNA의 양적인 변화와는 관련이 없었다. 세 주에서 공통적인PBP2x의 점돌연변이가 발견되어 기존에 보고된 페니실린 결합 단백의 돌연변이가 페니실린 비감수성 S. agalactiae의 내성 기전임을 확인하였다. 이들 환자에서 페니실린을 비롯한 항균제 사용력이 없다는 점에서 항균제 사용에 의해 돌연변이를 획득하기보다는 클론성 전파가 페니실린 비감수성 S. agalactiae 출현의 원인으로 판단된다. 국내 임상미생물검사실에서는 S. agalactiae 임상분리주에 대한 항균제 감수성검사를 실시하고 내성율에 대한 결과를 지속적으로 감시 관찰할 것이 요구된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.