재조합 대장균의 세포외분비를 통한 single-chain variable fragment의 생산공정에 관한 연구 Studies on the bioprocess of single-chain variable fragment from extracellular secretion by recombinant Escherichia coli원문보기
박상현
(과학기술연합대학원대학교 KRIBB school
생명공학(Biotechnology) 생물공정공학
국내석사)
항체는 질병을 일으키는 세균, 바이러스, 종양세포 등 유해물질에 대응하기 위해 면역 시스템으로부터 만들어지는 단백질로써 항원에 대한 특이성으로 수요에 따라 치료제 및 진단제 용도로 다양한 연구가 진행되고 있다. 치료용 항체(therapeutic antibodies)의 종류에는 인간화 항체(humanized antibody)와 인간 항체(human monoclonal antibody), 항체 절편(antibody fragment), 이중특이항체(bispecific antibody) 등이 있다. 항체치료제는 ...
항체는 질병을 일으키는 세균, 바이러스, 종양세포 등 유해물질에 대응하기 위해 면역 시스템으로부터 만들어지는 단백질로써 항원에 대한 특이성으로 수요에 따라 치료제 및 진단제 용도로 다양한 연구가 진행되고 있다. 치료용 항체(therapeutic antibodies)의 종류에는 인간화 항체(humanized antibody)와 인간 항체(human monoclonal antibody), 항체 절편(antibody fragment), 이중특이항체(bispecific antibody) 등이 있다. 항체치료제는 동물세포를 이용하는 것이 일반적이지만 생산 단가가 높고 다루기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 이를 극복하기 위해 미생물을 이용하여 Fab과 single-chain variable fragment (scFv), minibody 등의 항체 절편에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 scFv는 종양 및 기타 조직에 더 빠르게 침투할 수 있으며 불변 영역(constant region)을 갖고 있지 않아 혈액 내에서의 소멸 속도가 빠른 장점이 있다. 하지만 미생물을 이용한 재조합 항체 생산 방법은 세포질 내에 발현된 항체가 단백질 분해효소(protease)에 의해 분해되거나 정확한 단백질 접힘이 일어나지 않고 세포 내에서 비활성 봉입체(inclusion body)로 응집되는 문제점을 가진다. 따라서 본 연구에서는 여드름을 발생 원인이 되는 박테리아인 Propionibacterium acnes에 의한 여드름의 치료에 효과적인 scFv 발현을 재조합 대장균 내에서 할 때, 단백질의 이황화 결합 형성에 효과적이며 periplasm으로 발현을 유도하는 신호 서열(signalpeptide)인 pelB와 MBP, 그리고 periplasm에서 올바른 접힘을 도와주는 chaperone을 통하여 scFv의 가용성을 높이기 위한 연구를 수행하였다. 또한 scFv의 세포외분비를 촉진하기 위하여 Triton X-100, Tween 80, glycine 및 sucrose 등의 화학물질 첨가 농도에 따른 scFv의 세포외분비 효율을 비교하였다. 본 연구를 통하여 signal peptide인 pelB를 포함한 균주가 플라스크 배양에서 더 많은 가용성 단백질로 발현되는 것을 확인하였으며, periplasmic chaperone인 Skp를 공동 발현(co-expression) 시켰을 때 배양액으로 더 많은 scFv가 분비되었다. Skp를 공동 발현하는 균주는 세포 농도 대비 가용성 scFV 발현량이 모균주에 비해 2.16배 많았고 세포 농도 대비 분비된 scFv의 양은 1.42배 많았다. 또한, 플라스크 배양에서 scFv의 세포외분비를 촉진하기 위한 Triton X-100과 Tween 80, sucrose, glycine의 첨가에서는 Triton X-100을 2%로 처리한 조건에서 다른 첨가제보다 높은 세포외분비율을 보였으나, 5 L 발효기에서는 0.05%의 Triton X-100 농도로 최적화할 수 있었다. 이런 결과는 향후에 scFv의 대량생산을 위한 scale-up 과정에서 재조합 대장균의 세포외분비 생산을 위한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
항체는 질병을 일으키는 세균, 바이러스, 종양세포 등 유해물질에 대응하기 위해 면역 시스템으로부터 만들어지는 단백질로써 항원에 대한 특이성으로 수요에 따라 치료제 및 진단제 용도로 다양한 연구가 진행되고 있다. 치료용 항체(therapeutic antibodies)의 종류에는 인간화 항체(humanized antibody)와 인간 항체(human monoclonal antibody), 항체 절편(antibody fragment), 이중특이항체(bispecific antibody) 등이 있다. 항체치료제는 동물세포를 이용하는 것이 일반적이지만 생산 단가가 높고 다루기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 이를 극복하기 위해 미생물을 이용하여 Fab과 single-chain variable fragment (scFv), minibody 등의 항체 절편에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 scFv는 종양 및 기타 조직에 더 빠르게 침투할 수 있으며 불변 영역(constant region)을 갖고 있지 않아 혈액 내에서의 소멸 속도가 빠른 장점이 있다. 하지만 미생물을 이용한 재조합 항체 생산 방법은 세포질 내에 발현된 항체가 단백질 분해효소(protease)에 의해 분해되거나 정확한 단백질 접힘이 일어나지 않고 세포 내에서 비활성 봉입체(inclusion body)로 응집되는 문제점을 가진다. 따라서 본 연구에서는 여드름을 발생 원인이 되는 박테리아인 Propionibacterium acnes에 의한 여드름의 치료에 효과적인 scFv 발현을 재조합 대장균 내에서 할 때, 단백질의 이황화 결합 형성에 효과적이며 periplasm으로 발현을 유도하는 신호 서열(signal peptide)인 pelB와 MBP, 그리고 periplasm에서 올바른 접힘을 도와주는 chaperone을 통하여 scFv의 가용성을 높이기 위한 연구를 수행하였다. 또한 scFv의 세포외분비를 촉진하기 위하여 Triton X-100, Tween 80, glycine 및 sucrose 등의 화학물질 첨가 농도에 따른 scFv의 세포외분비 효율을 비교하였다. 본 연구를 통하여 signal peptide인 pelB를 포함한 균주가 플라스크 배양에서 더 많은 가용성 단백질로 발현되는 것을 확인하였으며, periplasmic chaperone인 Skp를 공동 발현(co-expression) 시켰을 때 배양액으로 더 많은 scFv가 분비되었다. Skp를 공동 발현하는 균주는 세포 농도 대비 가용성 scFV 발현량이 모균주에 비해 2.16배 많았고 세포 농도 대비 분비된 scFv의 양은 1.42배 많았다. 또한, 플라스크 배양에서 scFv의 세포외분비를 촉진하기 위한 Triton X-100과 Tween 80, sucrose, glycine의 첨가에서는 Triton X-100을 2%로 처리한 조건에서 다른 첨가제보다 높은 세포외분비율을 보였으나, 5 L 발효기에서는 0.05%의 Triton X-100 농도로 최적화할 수 있었다. 이런 결과는 향후에 scFv의 대량생산을 위한 scale-up 과정에서 재조합 대장균의 세포외분비 생산을 위한 기초자료가 될 것으로 사료된다.
Antibodies are proteins produced by the immune system to counter disease-causing bacteria, viruses, tumor cells. Due to their specificity for antigens, antibodies are being studied on their role as therapeutic agents and diagnostic agents according to demand. Types of therapeutic antibodies include ...
Antibodies are proteins produced by the immune system to counter disease-causing bacteria, viruses, tumor cells. Due to their specificity for antigens, antibodies are being studied on their role as therapeutic agents and diagnostic agents according to demand. Types of therapeutic antibodies include humanized antibodies, human monoclonal antibodies, antibody fragments, and bispecific antibodies. Generally, animal cells are used in the production of antibody therapeutics, but this has proven costly to produce and difficult to handle. To solve these issues, research on antibody fragments such as Fab, scFv, and minibody using microorganisms has been actively explored. Among them, scFv has the advantage of being able to penetrate more rapidly into tumors and other tissues and rapid clearance from blood since it does not have a constant region. However, the production of recombinant antibodies using microorganisms has its drawbacks in that the antibodies expressed in the cytoplasm are degraded by proteases or incorrect folding of proteins tend to occur leading to their aggregation into an inclusion body within cells. In this study, signal peptide effective in the formation of disulfide bonds of proteins in recombinant Escherichia coli cell and chaperone which helps correct folding in periplasm are used for increasing the solubility of scFv. Also, in order to promote the extracellular secretion of scFv, changes in extracellular secretion according to the concentration of chemical substances such as Triton X-100, Tween 80, glycine and sucrose were explored. As a result, the strain including pelB was expressed more soluble scFv protein and co-expressing Skp was secreted more protein to the culture medium in flask culture. The strain co-expressing Skp had 2.16 times more soluble scFv compared to the cell concentration and 1.42 times more secreted protein compared to the cell concentration compared to the parent strain. In addition, the addition of Triton X-100, Tween 80, sucrose, and glycine to promote the extracellular secretion of scFv in flask culture showed higher extracellular secretion rate than other additives under the condition that Triton X-100 was treated with 2%. But when using 5 L fermenter, it was confirmed that a lower concentration of Triton X-100 should be added. In the future, it will be a basic data for mass production of scFv using recombinant E. coli by scaling up based on optimized conditions.
Antibodies are proteins produced by the immune system to counter disease-causing bacteria, viruses, tumor cells. Due to their specificity for antigens, antibodies are being studied on their role as therapeutic agents and diagnostic agents according to demand. Types of therapeutic antibodies include humanized antibodies, human monoclonal antibodies, antibody fragments, and bispecific antibodies. Generally, animal cells are used in the production of antibody therapeutics, but this has proven costly to produce and difficult to handle. To solve these issues, research on antibody fragments such as Fab, scFv, and minibody using microorganisms has been actively explored. Among them, scFv has the advantage of being able to penetrate more rapidly into tumors and other tissues and rapid clearance from blood since it does not have a constant region. However, the production of recombinant antibodies using microorganisms has its drawbacks in that the antibodies expressed in the cytoplasm are degraded by proteases or incorrect folding of proteins tend to occur leading to their aggregation into an inclusion body within cells. In this study, signal peptide effective in the formation of disulfide bonds of proteins in recombinant Escherichia coli cell and chaperone which helps correct folding in periplasm are used for increasing the solubility of scFv. Also, in order to promote the extracellular secretion of scFv, changes in extracellular secretion according to the concentration of chemical substances such as Triton X-100, Tween 80, glycine and sucrose were explored. As a result, the strain including pelB was expressed more soluble scFv protein and co-expressing Skp was secreted more protein to the culture medium in flask culture. The strain co-expressing Skp had 2.16 times more soluble scFv compared to the cell concentration and 1.42 times more secreted protein compared to the cell concentration compared to the parent strain. In addition, the addition of Triton X-100, Tween 80, sucrose, and glycine to promote the extracellular secretion of scFv in flask culture showed higher extracellular secretion rate than other additives under the condition that Triton X-100 was treated with 2%. But when using 5 L fermenter, it was confirmed that a lower concentration of Triton X-100 should be added. In the future, it will be a basic data for mass production of scFv using recombinant E. coli by scaling up based on optimized conditions.
주제어
#세포외분비 유가식 배양 Propionibacterium acnes Single-chain variable fragment pelB
학위논문 정보
저자
박상현
학위수여기관
과학기술연합대학원대학교 KRIBB school
학위구분
국내석사
학과
생명공학(Biotechnology) 생물공정공학
지도교수
이홍원
발행연도
2021
총페이지
74
키워드
세포외분비 유가식 배양 Propionibacterium acnes Single-chain variable fragment pelB
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.