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논문 상세정보

T4 DNA Ligase의 반응 양상에 대한 특성 연구

Characteristic Mode of Action of T4 DNA Ligase

한국생화학회지 v.19 no.3 , 1986년, pp.301 - 306  
초록

T4 DNA ligase는 여러 제한효소로 잘려진 DNA 조각들을 결합시키는 효소로 유전자 조작에 필수불가결한 도구로 이용되고 있다. 본 실험에서는 Eco RI, Pst I, Hind III, 그리고 Sma I 제한효소로 자른 pUC9 DNA를 기질로하여 이 효소의 반응 양상에 대한 특성을 연구하였다. Eco RI, Pst I, Hind III, 그리고 Sma I으로 자른 pUC9을 결합하는 최적 온도는 각각 6, 12, 6, $24^{\circ}C$이었으며, 온도에 따른 결합곡선은 cohesive end가 S자형, blunt end가 종모양이였다. 이들 결합효율은 제한효소를 자른 DNA 조각내에 있는 염기 구성에 따라 다르게 나타났으며, 6개 염기중 양쪽 끝2개 염기가 결합 반응에 중요한 역할을 한다고 생각되어 진다. 이 효소의 최대 활성도를 위해 cohesive end에 1.0 mM ATP, blunt end에 0.2 mM ATP 가 요구되었다. 이 두 말단들이 결합은 $Na^+$, $K^+$, ${NH_4}^{+}$, 그리고 $Cs^+$ 같은 일가 양이온들과 spermine, spermidine같은 polyamine. 그리고 phosphate에 의해 저해되었고, blunt end 결합반응은 이들에 대해 더 급격히 감소되었다. Ethidium bromide는 반대 현상을 보였다. 또한 blunt end 결합은 효소 농도에 직선적인 관계를 보이지 않았다. 이들 결과로 부터 cohesive end 결합은 기질이 양쪽 2개 염기와 안쪽 4개 염기의 수소 결합으로 효소가 반응 하기에 적절한 위치로 놓여져 즉시 결합이 일어나게 되며, blunt end 결합은 DNA에 먼저 결합된 효소들 간의 상호 작용으로 기질을 유도해 기질의 국부 농도를 높여 반응이 일어나게 된다는 사실을 제시할 수 있었다.

Abstract

The activity of T4 DNA ligase on cohesive ends as well as blunt ends of DNA fragments was studied. Optimum temperatures for joining DNA fragments digested by Eco RI, Pst I, Hind III, and Sma I were 6, 12, 6 and $24^{\circ}C$, respectively. Ligation efficiency of Eco RI-pUC 9 was higher than that of Hind III-pUC 9 and lower than that of Pst I-pUC 9 and very much higher than that of Sma I-pUC 9. The optimum concentrations of A TP for ligation of the two types of the substrates were different, l.0 mM for cohesive ends and 0.2 mM for blunt ends. Both reactions were inhibited by monovalent cations, polyamines, phosphate and ethidium bromide. The ligation of blunt ends was more sensitive to these effectors except ethidium bromide than that of cohesive ends. The joining of blunt ends showed a non-linear dependency on enzyme concentration. Based on these results, the characteristic mode of action of T4 DNA ligase was suggested that the substrates are juxtapositioned by hydrogen bond for joining cohesive ends and the substrates are oriented by interaction between enzymes bound to DNA for blunt ends.

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