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문제 정의
- 11~13) 그러나 본 실험실에서 구축한 in situ cellular ELISA 검색법은 바이러스의 생존율을 측정함으로써 항바이러스 활성효과를 직접적으로 검색하는 방법으로 기존의 방법과 비교해볼 때보다 정확한 정량법이라 할 수 있다. 본 연구는 감기예방 및 치료의 목적으로 사용하고 있는 생약을 중심으로 항인 플루엔자 바이러스 활성을 검색한 결과 유자가 가장 강한 활성을 나타내어 활성이 있는 분획을 실험하였기에 보고하고자 한다.
- 본 연구는 한방 및 민간요법으로 주로 이용되는 생약 113종에 대한 1차 항바이러스 활성검색을 하여 유자에서 활성이 측정되었다. 유자에서 분리된 분획에 대한 2차 항바이러스 활성검색은 in situ cellular ELISA방법을 응용하였는데 활성 결과는 생존하는 바이러스의 양을 백분율로 환산하여 IC50 값으로 측정하였다.
제안 방법
- 세포가 접종된 plate는 37v, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음 각 welH 접종된 세포의 성장 정도와 분포도를 현미경으로 관찰하였다. DMEM 배지를 이용하여 부착되지 않은 세포를 세척하여 제거한 다음 인플루엔자 바이러스 액을 50 TCID"농도로 감염용 배지에 희석하여 한well당 100㎕씩 접종하고 blank와 세포가 접종된 마지막 칼럼에는 감염용 배지만을 가한 후 한 시간 동안 바이러스가 세포에 흡착되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 방치하였다. 상층액을 제거한 다음 2% FBS가 포함된 감염용 배지 90 B씩 분주하고 시료는 농도별로 희석하여 10 B씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4&시간 동안 배양하였다.
- MDCK 세포에서 바이러스를 증식하기 위해 사용한 바이러스 배양용 배지는 DMEM에 2% fetal bovine serum, 비타민, trypsin을 첨가하여 사용하였고 37℃, 5% CO2 보습 배양기에서 배양하였다.
- 바이러스 역가 (TCID50) 측정14)-수정란의 장뇨액에서 증식된 바이러스 역가를 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하였고 바이러스 역가는 TCID50값으로 정하였다. 생존세포의 미토콘드리아 내에 있는 succinate dehydrogenase 활성에 의해 3-[4, 5-Dimethylth-iazol-2-yl-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 가 환원되어 formazan 결정으로 침전되는 정도를 흡광도로 측정하는 MTT 검색법을 응용하여 바이러스에 의한 세포병변 정도를 측정함으로써 바이러스 역가를 계산하는 방법으로 사용하였다 .
- 바이러스 역가는 감염된 세포군과 비감염 대조 세포군의 흡광도를 기준으로 역가정도를 측정하였는데 감염 군에서 각 well로부터 한컬럼의 평균 0D 540 값을 구하여 대조군의 평균 OD 540 값에 대한 백분율을 산출한다. 이백분율은 대조군과 비교한 감염 군의 세포 생존율에 해당하는 값으로 TCIDe을 바이러스 역가의 지표로 사용하였으며 TCID50값은 Reed-Muench 공식을 이용하여 계산하였다.
- 바이러스 접종적정농도 결정- 5×104 TCID50값이 결정된 바이러스 배양 농축액을 이용하여 항바이러스활성을 측정하기 위해 바이러스 접종적정농도를 in situ ceUular ELISA 방법을 응용하여 측정한 결과 표준곡선은 Fig. 1과 같았고, 항바이러스 활성 측정을 위한 바이러스 접종적정농도는 50 TCID50으로 결정하였다.
- (H1N1)형을 국립보건원 호흡기바이러스과에서 분양받아 사용하였다. 바이러스를 증식시키기 위하여 SPF 수정란 (specifc pathogen free embryonated hen's egg)을 37℃ 부란 기에서 10일간부화시킨 후 오염된 수정란과 무정란을 제외한 수정란을 사용하였다. 수정란의 장뇨액 (allantoic fluid)에 바이러스를 0.
- 라고 할 수 있다. 본 실험은 현재까지 알려진 항 influenza virus 활성검색법을 보완하기 위하여 최근에 개발된 in situ cellular ELISA 방법을 응용하여 사용하였다.10) 기존의 항바이러스 검색법은 바이러스에 의해 세포가 감염됨으로써 세포병변을 보이는 세포 내에 존재하는 succinate dehydrogenase 또는 lactate dehydrogenase (LDH) 등의 효소가 증가하는 정도를 측정함으로써 시료에 대한 항바이러스 효과를 간접적으로 측정하는 방법이었다.
- DMEM 배지를 이용하여 부착되지 않은 세포를 세척하여 제거한 다음 인플루엔자 바이러스 액을 50 TCID"농도로 감염용 배지에 희석하여 한well당 100㎕씩 접종하고 blank와 세포가 접종된 마지막 칼럼에는 감염용 배지만을 가한 후 한 시간 동안 바이러스가 세포에 흡착되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 방치하였다. 상층액을 제거한 다음 2% FBS가 포함된 감염용 배지 90 B씩 분주하고 시료는 농도별로 희석하여 10 B씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4&시간 동안 배양하였다.
- 자동 96 well plate 세척기를 이용하여 세척액으로 4회 반복하여 세척하고 상층액을 완전히 제거한 후 goat anti-goat peroxidase가 접합된 항체(Chemicon)를 100 B씩 분주한 다음 30분간 37℃ 배 양기에서 배양한 후 위와 같은 방법으로 4회 세척하였다. 상층액을 충분히 제거하고 기질액인 3, 3', 5, 5'-tetramethybenzidine (TMB, Che-miconX 100 ㎕씩 분주한 다음 실온의 어두운 장소에서 30분간 반응시키고 IN sulfuric acid로 반응을 정지시켰다. ELISA 판독기 (Molecular Device, E max)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였는데 흡광도의 값은 생존하는 바이러스의 양으로 항바이러스 활성효과를 측정할 수 있다.
- 생존세포의 미토콘드리아 내에 있는 succinate dehydrogenase 활성에 의해 3-[4, 5-Dimethylth-iazol-2-yl-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 가 환원되어 formazan 결정으로 침전되는 정도를 흡광도로 측정하는 MTT 검색법을 응용하여 바이러스에 의한 세포병변 정도를 측정함으로써 바이러스 역가를 계산하는 방법으로 사용하였다 .
- 세포 및 바이러스 고정10)-배양된 96 well plate는 현미경을 이용하여 시료에 의한 세포독성을 관찰한 다음 세포 독성이 없는 시료에 대해서만 ELISA 실험을 하였는데 이는 정확한 바이러스 생존율을 측정하기 위해서였다. 배양된 96 well plate는 Phosphate buffered saline (PBS, Gibco)으로 1회 세척하고 세포와 바이러스를 고정하기 위해 에탄올과 아세톤을 동량으로 혼합한 고정액을 -20℃에 보관하여 준비하였다가 각 well에 100 ㎕ 가 하여 15분간 -20℃에서 방치하여 고정시켰다.
- 여기에 MDCK 세포를 2X1(/ cells/well 농도로 접종하고 마지막 칼럼에는 세포 부유액 대신 배지만을 가해 흡광도측정 시 blank로 사용하였다. 세포가 접종된 plate는 37v, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음 각 welH 접종된 세포의 성장 정도와 분포도를 현미경으로 관찰하였다. DMEM 배지를 이용하여 부착되지 않은 세포를 세척하여 제거한 다음 인플루엔자 바이러스 액을 50 TCID"농도로 감염용 배지에 희석하여 한well당 100㎕씩 접종하고 blank와 세포가 접종된 마지막 칼럼에는 감염용 배지만을 가한 후 한 시간 동안 바이러스가 세포에 흡착되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 방치하였다.
- 바이러스를 증식시키기 위하여 SPF 수정란 (specifc pathogen free embryonated hen's egg)을 37℃ 부란 기에서 10일간부화시킨 후 오염된 수정란과 무정란을 제외한 수정란을 사용하였다. 수정란의 장뇨액 (allantoic fluid)에 바이러스를 0.2 ㎖ 씩 접종시킨 후 파라핀 왁스로 접종입구를 막고, 37℃에서 2일간 증식시키고 4℃에서 18시간 동안 방치시킨 다음 수정란 한 개당 10 ㎖의 장뇨액을 추출하였다. 바이러스가.
- 8 g)을 얻었다. 열수 추출물을 물에 현탁시킨 후 MeOH을 증량시켜 극성을 변화시키면서 Amberlite XAD-4 gel을 사용한 column chromatography 를 실시하여 H2O, 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH 및 100% MeOH 분획으로 나누어 항바이러스 활성을 측정하였다. 이들 분획 중에서 항바이러스 활성이 강하게 나타난 40% MeOH과 60% MeOH 분획을 Sephadex LH-20 gel을 이용한 column chromatography를 각각 실시하여 6개의 분획과 4개의 분획으로 나누었다.
- 활성이 측정되었다. 유자에서 분리된 분획에 대한 2차 항바이러스 활성검색은 in situ cellular ELISA방법을 응용하였는데 활성 결과는 생존하는 바이러스의 양을 백분율로 환산하여 IC50 값으로 측정하였다. 유자에서 분리된 각 분획에 대한 항바이러스 효과를 검색한 결과는 Table I과 같았고, 각 분획의 농도에 따른 바이러스 저해 효과는 Fig.
- 열수 추출물을 물에 현탁시킨 후 MeOH을 증량시켜 극성을 변화시키면서 Amberlite XAD-4 gel을 사용한 column chromatography 를 실시하여 H2O, 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH 및 100% MeOH 분획으로 나누어 항바이러스 활성을 측정하였다. 이들 분획 중에서 항바이러스 활성이 강하게 나타난 40% MeOH과 60% MeOH 분획을 Sephadex LH-20 gel을 이용한 column chromatography를 각각 실시하여 6개의 분획과 4개의 분획으로 나누었다.
대상 데이터
- 감수성 세포와 배지- 항바이러스 활성을 in vitro에서 검색하기 위해 influenza virus에 대한 감수성 숙주세포인 Madin-Darby Cainine Kidney (MDCK) 세포주를 한국 세포주은행에서 분양받아 계대 배양하여 사용하였다. MDCK 세포는 influenza virus에 의해 감염되어 세포병변을 일으키는 특징을 가지는 세포주로 배양용 배지는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco)에 2% fetal bovine serum(FBS, Gibco)을 첨가하여 사용하였고, 배양조건은 37℃, 5% CO2로 유지된 보습 배양기에서 배양하였다.
- 바이러스 증식 및 보관- 바이러스는 influenza virus A/Iaiwan/1/86 (H1N1)형을 국립보건원 호흡기바이러스과에서 분양받아 사용하였다. 바이러스를 증식시키기 위하여 SPF 수정란 (specifc pathogen free embryonated hen's egg)을 37℃ 부란 기에서 10일간부화시킨 후 오염된 수정란과 무정란을 제외한 수정란을 사용하였다.
- 실험 재료 -실험재료로 사용한 유자는 전남 고흥 유자시험장에서 채취한 후 절단하여 신선한 상태로 실험에 사용하였다.
- 활성물질의 분획- 유자나무의 열매, 유자 (柚子)를신선한 상태로 실험 재료에 사용하였다. 유자(4 kg)를 열수로 2회 반복 추출한 후 저온에서 감압농축하여 추출물 (279.
데이터처리
- ELISA 판독기 (Molecular Device, E max)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였는데 흡광도의 값은 생존하는 바이러스의 양으로 항바이러스 활성효과를 측정할 수 있다. 시료를 처리하지 않은 바이러스 생존군에서 세포 접종군의 흡광도 값을제한 값으로 시료를 처리한 바이러스 생존군에서 순수세포접종군의 흡광도 값을 제한 값을 나누어 계산한 다음 백분율 값을 산출하였는데 이는 바이러스 생존율에 해당하는 것으로 Sigma plot 프로그램을 이용하여 IC50 값을 계산하였다. 50% 억제 농도 (IC50) 는 바이러스 생존율이 50%가 되도록 하는 약물의농도로 정의하였고 IC50 값을 항바이러스 효과의 지표로 사용하였다.
이론/모형
- MDCK 세포는 influenza virus에 의해 감염되어 세포병변을 일으키는 특징을 가지는 세포주로 배양용 배지는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco)에 2% fetal bovine serum(FBS, Gibco)을 첨가하여 사용하였고, 배양조건은 37℃, 5% CO2로 유지된 보습 배양기에서 배양하였다. 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion 방법으로 확인하였고 3~4일에 한 번씩 계대하여 ㎖ 당 2.0-3.0×105개의 세포 분포도로 유지하며 사용하였다.
- 산출한다. 이백분율은 대조군과 비교한 감염 군의 세포 생존율에 해당하는 값으로 TCIDe을 바이러스 역가의 지표로 사용하였으며 TCID50값은 Reed-Muench 공식을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
- 19 ㎍/㎖ 농도에서 활성이 측정되었다. 60% MeOH 분획에서 60-1, 60-2, 60-3, 60-4, 60-5, 60-6 등 6개의 분획을 얻어 항바이러스 활성을 측정한 결과 60-1 분획은 세포독성이 강하게 측정되어 바이러스에 대한 직접적인 항바이러스 효과를 측정하기가 불가능하였고, 60-2와 60-3은 각각 IC50 값이 987㎍/㎖과 962.6 ㎍/㎖농도에서 활성이 측정되었다. 본 실험 결과에 의해 유자에 대한 항바이러스 활성이 처음으로 측정되었고 40% MeOH 분획에서 항바이러스 활성이 가장 강하게 측정되어 바이러스의 증식을 억제하는 성분이 존재할 것으로 기대되었다.
- 바이러스 농도 결정- 항바이러스 활성 측정을 위한 바이러스 농도를 결정하기 위하여 바이러스 증식액을 10배로 계단 희석하여 MTT법으로 측정한 결과 희석농도에 따른 바이러스 역가의 표준 곡선을 정한 다음 실험에 사용될 바이러스 농축액의 농도는 TCID50값으로 정하였는데 Reed-Muench 공식을 이용하여 계산한 결과 바이러스 농축액의 역가는 5×104 TCID50으로정해졌다.
- 6 ㎍/㎖농도에서 활성이 측정되었다. 본 실험 결과에 의해 유자에 대한 항바이러스 활성이 처음으로 측정되었고 40% MeOH 분획에서 항바이러스 활성이 가장 강하게 측정되어 바이러스의 증식을 억제하는 성분이 존재할 것으로 기대되었다. 열수엑스뿐만 아니라 여러 분획들에서 활성이 측정되어 감기 걸렸을 때 민간요법으로 유자차를 비롯하여 유자를 사용하는 것이 선조들의 지혜가 뛰어나다는 것을 입증하고 유자를 차 형태로 애용할 뿐만 아니라 보다 복용이 간편하고 쉽게 접할 수 있는 다른 형태의 제품 개발이 요구된다.
- 본 연구는 항바이러스 물질을 천연물로부터 개발하기 위해 113종의 생약을 대상으로 항인 플루엔자 활성을 검색한 결과 Citrus junos가 활성이 높은 것으로 측정되었다. 최근 바이러스의 신속한 정량법으로 보고되는 in situ cellular ELISA 방법을 구축하여 Citrus junos 분획들에 대한 항바이러스 활성을 측정한 결과 40% MeOH 분획의 IC50 값이 361.
- 2로 나타내었다. 유자의 열수 추출물을 Amberlite XAD-4 gel 을 사용하여 column chromatography를 실시한 결과 H20, 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH, 100% MeOH 분획을 얻었다. 이 분획들 중에 80%, 100% MeOH 분획에서는 세포독성이 강하게 측정되어 바이러스에 대한 직접적인 항바이러스효과를 측정하기가 불가능하였고 40% MeOH과 60% MeOH 분획에서 각각 IC50값이 361.
- 유자의 열수 추출물을 Amberlite XAD-4 gel 을 사용하여 column chromatography를 실시한 결과 H20, 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH, 100% MeOH 분획을 얻었다. 이 분획들 중에 80%, 100% MeOH 분획에서는 세포독성이 강하게 측정되어 바이러스에 대한 직접적인 항바이러스효과를 측정하기가 불가능하였고 40% MeOH과 60% MeOH 분획에서 각각 IC50값이 361.5 ㎍/㎖과 676.08㎍/㎖로 활성이 나타났으나 나머지 분획에서는 활성을 보이지 않았다. 40% MeOH 분획에서 분리된 40-1, 40-2, 40-3, 40-4 분획 중에 40-1과 40-2 분획에서는 세포독성이 강하게 측정되어 바이러스에 대한 직접적인 항바이러스 효과를 측정하기가 불가능하였고 40-4 분획의 IC50 값은 677.
- 최근 바이러스의 신속한 정량법으로 보고되는 in situ cellular ELISA 방법을 구축하여 Citrus junos 분획들에 대한 항바이러스 활성을 측정한 결과 40% MeOH 분획의 IC50 값이 361.5㎍/㎖로 가장 효과적으로 측정됨으로써 추후 새로운 항바이러스 물질 개발의 가능성을 보여 주었다.
후속연구
- 열수엑스뿐만 아니라 여러 분획들에서 활성이 측정되어 감기 걸렸을 때 민간요법으로 유자차를 비롯하여 유자를 사용하는 것이 선조들의 지혜가 뛰어나다는 것을 입증하고 유자를 차 형태로 애용할 뿐만 아니라 보다 복용이 간편하고 쉽게 접할 수 있는 다른 형태의 제품 개발이 요구된다. 현재 활성분획으로부터 단일 물질 분리 및 동정에 대한 연구는 진행 중에 있으며 향후 동물실험과 항바이러스 작용기작을 밝히는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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