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문제 정의
- 본 논문에서는 LTB4 수용체 저해활성을 가진 물질 을 천식 또는 염증치료를 위한 의약품으로 개발하려 는 노력의 일환으로, 각종 생약재료의 메탄올추출물 및 각종 용매분획의 LTB4 수용체결합 저해활성을 검 색한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 8% NaCl로 등장액으로 하고 4℃에서 500 g로 5분간 원심분리한 후 침전으로 얻어진 호중구를 HBSS 배지에 분산하였다. Hemocytometer 를 이용하여 호중구의 농도를 3×1-7cells/ml로 조정하고, 분리된 호중구는 1시간 이내에 LTB4 수용체 결합저해 활성 검정을 위한 실험에 사용하였다.
- 또한 LTB4 수용체에 대한 결합 저해활성 뿐 아니라 5-LO에 대한 저해활성 가능성까지 고려하고 기존에 알려진 이들 저해제들의 구조를 참조할 때,17,18) hexane 가용분획으로 활성이 집중되는 지모 및 호미 초를 활성 성분의 연구대상으로 선정하였다. 그래서 지 모와 호미 초의 hexane 가용분획을 실리카겔을 고정상으로 컬럼크로마토그래피하여 각각 4개의 소분획으로 나누고, 30ug/ml 농도에서 활성을 검정한 결과를 Fig. 1 과 Fig. 2에 나타내었다. 두 식물의 컬럼분획 모두극성이 강한 4번째의 분획인 AA-4와 ES-4에서 각각 78%와 62%의 강한 LTB4 결합 저해활성이 관찰되었다.
- 5㎛)로 처리하였을 때의 cpm으로 하였다. 따라서 특 이적 결합 (specific binding; SB)은 총결합과 비특이 적 결합의 차이 (시료대신 완충액 처리의 경우: TBcont - NB = SBcont)또는 시료처리의 경우: TBsamp-NB = SBsamp)로 구하였다. 수용체에 대한 시료의 LTB4, 리간드 결합 저해정도는 저해율 (%)로 표현하였으며 이 값은 다음의 식으로부터 구하였다.
- LTB4는 선택적인 세포표면의 수용체에 결합하여 활성을 나타내므로, 천식 또는 염증치료 목적으로 LT3의 활성을 감소시키는 방법으로 LTB4 수용체에 대한 저해제의 개발이 가장 선택적이고 효율적인 수단으로 이용되고 있다. 생약으로부터 새로운 골격의 LTB4 수용체 저해제를 찾기 위한 노력으로 한방에서 사용되는 생약의 추출물에 대하여 LTB4 수용체 결합 저해활성을 검색하였다. 활성의 평 가는 사람의 혈액에서 분리한 호중구에 대한 동위원소가 표지된 [3H]-LTB4 리간드의 결합을 억제하는 능력으로 평가하였다.
- 5 nM)용액을 가하였다. 이때 시료의 용매는 ImM Ca2+와 5mM Mg2+를 함유한 HBSS 배지였으며 호중구는 시험관 당 3×106 세포를 100㎕에 분산하여 사용하였다. 0℃의 얼음물에서 정확히 45분간 유지한 후 0℃의 Tns 완충액 (pH 7.
- 나타내었다. 일차로 각 식물재료의 메탄올 냉침 추출물에 대하여 100ug/ml 농도에서 활성을 검정한 후, 계속적인 활성검정의 필요가 있는 재료에 대해서는 haxane 가용분획, EtOAc 가용분획 및 최종 수층에대한 활성을 검정하였다. 메탄올 추출물 상태에서는 상백피, 소자, 행인 및 산두근이 70% 이상의 강한활성을 나타내었으며, 메탄올 추출물에 대한 활성정도가 10% 이하로 매우 미약한 도인, 갈근, 내복자, 복분자 및 백부근은 용매분획에 대한 활성검정 실험에서 제외하였다.
- 메탄올 추출물 상태에서는 상백피, 소자, 행인 및 산두근이 70% 이상의 강한활성을 나타내었으며, 메탄올 추출물에 대한 활성정도가 10% 이하로 매우 미약한 도인, 갈근, 내복자, 복분자 및 백부근은 용매분획에 대한 활성검정 실험에서 제외하였다. 지모, 호미초, 산두근, 후박, 소자등은 활성이 hexane 가용분획으로 이행되었으며, 마두령, 애엽, 두충, 행인, 목향, 상백피 등은 EtOAc 가용분획으로 활성이 이행되었다. 특히 lOOeg/ml 농도에서 지모의 hexane 가용분획과 EtOAc 가용분획, 마두령의 EtOAc 가용분획, 마황의 hexane 가용분획 및 호미초의 hexane 가용분획 등이 80% 이상의 강력한 호중구에 대한 LTB4 결합저해 활성을 나타내었다.
- 지모의 hexane 가용분획 (640 mg)과 호미초의 hexane 가용분획 (500 mg)에 대하여 각각, 실리카겔 30g을 이용하여 hexane/EtOAc (100:1 → 75:1 → 50:1 → 20:1 → 10:1 → 1:1) 를 이동상으로 극성을 증가시키면서 컬럼크로마토그래피하여 4개의 소분획으로 나누었다.
- 추출 및 분획 - 식물재료는 건조한 상태에서 메탄 올로 3회 냉침하여 추출하고, 추출물을 감압 하에서 농축한 후 물에 분산하고 n-hexane으로 추출하여 nhexane 가용분획을 얻고, 물 층을 다시 EtOAc로 추출하여 EtOAc 가용분획 및 최종 물분획으로 나누어 각각에 대한 LTB4 수용체에 대한 저해작용을 검정하였다.
- 상등액을 합하여 4℃에서 500 g로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 침전에 일부 유입된 적혈구를 용혈 제거하기 위해 증류수를 가해 20초 동안 방치한 후 동일 부피의 1.8% NaCl로 등장액으로 하고 4℃에서 500 g로 5분간 원심분리한 후 침전으로 얻어진 호중구를 HBSS 배지에 분산하였다. Hemocytometer 를 이용하여 호중구의 농도를 3×1-7cells/ml로 조정하고, 분리된 호중구는 1시간 이내에 LTB4 수용체 결합저해 활성 검정을 위한 실험에 사용하였다.
- Cell harvester 를 이용하여 GF/B 필터로 여과하고 차가운 Tris 완충액으로 30초간 세척하였다. 필터를 12시간 공기 중에서 건조하고 Liquid scintillation counter에서 방사능을 측정함으로써 수용체에 결합된 LTB4, 를 정량하였다. 16)
- 혈액으로 부터 호중구의 분리 -사람의 혈액은 대한적십자사 혈액원에서 실험 당일 오전에 채혈한 신선한 혈액을 구매하여 알려진 방법에 준하여 호중구를 분리하였다.11,12)우선 100 ml의 혈액을 250 ml의 원심분리관에 취한 후 Ca2+, Mg2+를 함유하지 않은 HBSS 배지를 가해 200ml로 하고 혼합하여 혈액을 희석하였다.
- 50 ml 원심분리관에서 희석혈액과 Ficoll/ Paque가 27:10 (v/v)의 비율이 되도록 혼액을 Ficoll- P&que에 조심스럽게 상층으로 가하고 상온에서 500 g로 30분간 원심분리하였다. 혈장을 함유한 HBSS층, 중간층 및 단핵구충까지 버리고, 다시 HBSS 배지를각 원심분리관의 15 ml 위치까지 가하였다. 계속하여동일 부피의 3% dextran (0.
- 호 중구의 표면에는 LTB4 수용체가 존재하는 것으로 알려져 있어 LTB4 수용체에 대한 연구에 많이 활용되고 있다. 호중구의 표면에 존재하는 수용체에 대한 리간드로는 Fhhtb, 를 사용하였으며 총결합 (total binding; TB)은 동위원소가 표지된 [3H]-LTB4 (0.5nM)만을 리간드로 사용한 경우의 cpm 값으로 하고 (시료대신 완충액 처리의 경우 TBcont, 시료처리의 경우 TBsamp), 비특이적 결합 (non-speciSc binding; NB)은 동위원소가 표지되지 않은 LTB4 리간드를 동위원소 표지된 [3H]-LTB4의 1000배에 해당하는 농도 (0.5㎛)로 처리하였을 때의 cpm으로 하였다. 따라서 특 이적 결합 (specific binding; SB)은 총결합과 비특이 적 결합의 차이 (시료대신 완충액 처리의 경우: TBcont - NB = SBcont)또는 시료처리의 경우: TBsamp-NB = SBsamp)로 구하였다.
- 생약으로부터 새로운 골격의 LTB4 수용체 저해제를 찾기 위한 노력으로 한방에서 사용되는 생약의 추출물에 대하여 LTB4 수용체 결합 저해활성을 검색하였다. 활성의 평 가는 사람의 혈액에서 분리한 호중구에 대한 동위원소가 표지된 [3H]-LTB4 리간드의 결합을 억제하는 능력으로 평가하였다.
대상 데이터
- 식물재료의 추출용 용매는 공업용을 증류하여 사용하였고, 용매분획의 제조 및 컬럼크로마토그래피를 위해서는 시약용을 구매하여 사용하였으며, 컬럼용 실리카겔은 Merck사의 Kieselgel 60 (230-400 mesh)를 사용하였다. Cell harvester는 Brandel사의 M-12 Mod사을, 원심분기기는 Sorvall사 의 RC2-B을, GF-B filter는 Brandel사의 제품을, Hquid scintillation counter는 Beckman사의 Model LS 6500을 각각 사용하였다.
- 3H]-LTB4는 Dupont NEN사에서, FicolLRque, Dextran T-500은 Pharmacia사에서, Hank's balanced salt solution (HBSS)은 Gibco사에서 구입하여 사용하였다. 식물재료의 추출용 용매는 공업용을 증류하여 사용하였고, 용매분획의 제조 및 컬럼크로마토그래피를 위해서는 시약용을 구매하여 사용하였으며, 컬럼용 실리카겔은 Merck사의 Kieselgel 60 (230-400 mesh)를 사용하였다.
- 이들 중 활성의 용량의존성이 우수하고 25ug/ml 농도에서도 여전히 양호한 활성을 나타내는 지모의 hexane 가용분획, 마두령의 EtOAc 가용분획, 호미초의 hexane 및 EtOAc 가용분획, 생강의 EtOAc 가용분획 등에 대해서는 계속적인 활성을 추적하는 연구를 통해 활성 성분의 구조를 확인할 수 있을 것으로 기대되었다. 또한 LTB4 수용체에 대한 결합 저해활성 뿐 아니라 5-LO에 대한 저해활성 가능성까지 고려하고 기존에 알려진 이들 저해제들의 구조를 참조할 때,17,18) hexane 가용분획으로 활성이 집중되는 지모 및 호미 초를 활성 성분의 연구대상으로 선정하였다. 그래서 지 모와 호미 초의 hexane 가용분획을 실리카겔을 고정상으로 컬럼크로마토그래피하여 각각 4개의 소분획으로 나누고, 30ug/ml 농도에서 활성을 검정한 결과를 Fig.
- 본 실험에 사용한 식물재료는 경동시장 의 한약건재상에서 구입하여 사용하였다.
- 는 Dupont NEN사에서, FicolLRque, Dextran T-500은 Pharmacia사에서, Hank's balanced salt solution (HBSS)은 Gibco사에서 구입하여 사용하였다. 식물재료의 추출용 용매는 공업용을 증류하여 사용하였고, 용매분획의 제조 및 컬럼크로마토그래피를 위해서는 시약용을 구매하여 사용하였으며, 컬럼용 실리카겔은 Merck사의 Kieselgel 60 (230-400 mesh)를 사용하였다. Cell harvester는 Brandel사의 M-12 Mod사을, 원심분기기는 Sorvall사 의 RC2-B을, GF-B filter는 Brandel사의 제품을, Hquid scintillation counter는 Beckman사의 Model LS 6500을 각각 사용하였다.
- 천연식물 재료로 부터 LTB4 수용체 결합저해작용 을 가진 물질을 검색하기 위해 한방에서 항염증, 천 식 등의 목적으로 사용되어 온 21종의 식물재료를 실 험대상으로 선정하였다. 식물 재료로 부터 제조한 시료의 LTB4 수용체 저해작용에 관한 실험에 사용한 수용체로는 사람 혈액으로부터 분리한 호중구를 사용 하였으며 이를 분리하기 위하여 Ficoll-Wque를 이용한 기울기 원심분리법과 dextran 침전법을 활용하였다.
이론/모형
- 수용체 결합저해작용 을 가진 물질을 검색하기 위해 한방에서 항염증, 천 식 등의 목적으로 사용되어 온 21종의 식물재료를 실 험대상으로 선정하였다. 식물 재료로 부터 제조한 시료의 LTB4 수용체 저해작용에 관한 실험에 사용한 수용체로는 사람 혈액으로부터 분리한 호중구를 사용 하였으며 이를 분리하기 위하여 Ficoll-Wque를 이용한 기울기 원심분리법과 dextran 침전법을 활용하였다. 호 중구의 표면에는 LTB4 수용체가 존재하는 것으로 알려져 있어 LTB4 수용체에 대한 연구에 많이 활용되고 있다.
성능/효과
- Leukotriene B4 (LTB4; 5S, 12R-dihydroxy-6, 14-cis-8, 10-trans-eicosatetraenoic acid)는 호중구로부터 처음 분리 동정되었으며,1) 그 후화학적으로 합성되어 호중구를 활성화하는 역할이 확인되었다.2) LTB4 주로 활성화된 호중구나 대식세포에 의해 합성되며, 면역활성화와 관련된 다양한 세포들의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고있다. LTB4는 arachidonic acid의 대표적인 두 가지대사 경로 중의 하나인 5-lipoxygenase (5-LO)에 의해 5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid (5-HPETE)와 LTA4를 경유하여 생성된다.
- 각종 생약재료의 메탄올 추출물 중 상백피, 소자, 행인 및 산두근이 100ug/ml 농도에서 70% 이상의 결합 저해활성을 나타내었다. 메탄올 추출물 수준에서 활성이 관찰된 재료로 부터 제조한 용매분획 중 특히 활성이 강하게 관찰된 분획들에 대하여 100, 50, 25 의 농도에서 활성을 검색한 결과, 지모, 호미 초의 hexane 가용분획과 마두령, 호미초, 생강의 EtOAc 가용분획이 매우 양호한 활성을 보였다.
- 특히 lOOeg/ml 농도에서 지모의 hexane 가용분획과 EtOAc 가용분획, 마두령의 EtOAc 가용분획, 마황의 hexane 가용분획 및 호미초의 hexane 가용분획 등이 80% 이상의 강력한 호중구에 대한 LTB4 결합저해 활성을 나타내었다. 대부분의 재료식물의 경우 최종 수층의 활성은 매우 약하게 관찰되었으나, 마황과 상백피는 특이하게물 층의 LTB4 결합 저해활성이 각각 65%와 89%로 매우 높게 확인되었다.
- 2에 나타내었다. 두 식물의 컬럼분획 모두극성이 강한 4번째의 분획인 AA-4와 ES-4에서 각각 78%와 62%의 강한 LTB4 결합 저해활성이 관찰되었다. 이 소분획을 구성하는 성분들이 각 식물의 EtOAc 가용분획에도 상당 부분 포함된 것을 TLC에서 확인할 수 있었으며, 이는 이들 식물들의 EtOAc 가용분획에서 비교적 강한 활성을 나타내는 주요 성분들인 것으로 예상할 수 있었다.
- 일차로 각 식물재료의 메탄올 냉침 추출물에 대하여 100ug/ml 농도에서 활성을 검정한 후, 계속적인 활성검정의 필요가 있는 재료에 대해서는 haxane 가용분획, EtOAc 가용분획 및 최종 수층에대한 활성을 검정하였다. 메탄올 추출물 상태에서는 상백피, 소자, 행인 및 산두근이 70% 이상의 강한활성을 나타내었으며, 메탄올 추출물에 대한 활성정도가 10% 이하로 매우 미약한 도인, 갈근, 내복자, 복분자 및 백부근은 용매분획에 대한 활성검정 실험에서 제외하였다. 지모, 호미초, 산두근, 후박, 소자등은 활성이 hexane 가용분획으로 이행되었으며, 마두령, 애엽, 두충, 행인, 목향, 상백피 등은 EtOAc 가용분획으로 활성이 이행되었다.
- 저해활성을 나타내었다. 메탄올 추출물 수준에서 활성이 관찰된 재료로 부터 제조한 용매분획 중 특히 활성이 강하게 관찰된 분획들에 대하여 100, 50, 25 의 농도에서 활성을 검색한 결과, 지모, 호미 초의 hexane 가용분획과 마두령, 호미초, 생강의 EtOAc 가용분획이 매우 양호한 활성을 보였다. 지모와 호미초의 hexane 가용분획으로 부터 실리카겔 컬럼을 통하여 얻은 소분획 AA-4와 ES-4는 30ug/ml 농도에서 LTB4 수용체 결합 저해활성이 각각 78% 및 62%로서 매우 우수하였다.
- 식물재료는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후 물로 희석하여 원하는 농도로 제조하였고, DMSO의 LTB4 결합실험계 내에서의 최종농도는 0.2% 이하로 조절하였으며 이 농도 이하에서는 ITTBq의 호중구의 수용체 결합에 영향이 없음을 예비실험에서 확인하였다.
- 두 식물의 컬럼분획 모두극성이 강한 4번째의 분획인 AA-4와 ES-4에서 각각 78%와 62%의 강한 LTB4 결합 저해활성이 관찰되었다. 이 소분획을 구성하는 성분들이 각 식물의 EtOAc 가용분획에도 상당 부분 포함된 것을 TLC에서 확인할 수 있었으며, 이는 이들 식물들의 EtOAc 가용분획에서 비교적 강한 활성을 나타내는 주요 성분들인 것으로 예상할 수 있었다.
- 메탄올 추출물 수준에서 활성이 관찰된 재료로 부터 제조한 용매분획 중 특히 활성이 강하게 관찰된 분획들에 대하여 100, 50, 25 의 농도에서 활성을 검색한 결과, 지모, 호미 초의 hexane 가용분획과 마두령, 호미초, 생강의 EtOAc 가용분획이 매우 양호한 활성을 보였다. 지모와 호미초의 hexane 가용분획으로 부터 실리카겔 컬럼을 통하여 얻은 소분획 AA-4와 ES-4는 30ug/ml 농도에서 LTB4 수용체 결합 저해활성이 각각 78% 및 62%로서 매우 우수하였다. 이와 같은 결과들로부터 생약 추출물의 활성 추적과정을 통하여 새로운 골격의 LTB4 수용체 저해제를 찾고 LTB4의 활성을 차단함으로써 소염 및 천식의 치료에 활용할 수 있는 물질의 도출이 가능할 것으로 기대된다.
- 지모, 호미초, 산두근, 후박, 소자등은 활성이 hexane 가용분획으로 이행되었으며, 마두령, 애엽, 두충, 행인, 목향, 상백피 등은 EtOAc 가용분획으로 활성이 이행되었다. 특히 lOOeg/ml 농도에서 지모의 hexane 가용분획과 EtOAc 가용분획, 마두령의 EtOAc 가용분획, 마황의 hexane 가용분획 및 호미초의 hexane 가용분획 등이 80% 이상의 강력한 호중구에 대한 LTB4 결합저해 활성을 나타내었다. 대부분의 재료식물의 경우 최종 수층의 활성은 매우 약하게 관찰되었으나, 마황과 상백피는 특이하게물 층의 LTB4 결합 저해활성이 각각 65%와 89%로 매우 높게 확인되었다.
후속연구
- 것으로 판단된 용매분획들에 대하여 세 가지의 농도 (100, 50, 25|ig/ml)로 처리한 결과이다. 이들 중 활성의 용량의존성이 우수하고 25ug/ml 농도에서도 여전히 양호한 활성을 나타내는 지모의 hexane 가용분획, 마두령의 EtOAc 가용분획, 호미초의 hexane 및 EtOAc 가용분획, 생강의 EtOAc 가용분획 등에 대해서는 계속적인 활성을 추적하는 연구를 통해 활성 성분의 구조를 확인할 수 있을 것으로 기대되었다. 또한 LTB4 수용체에 대한 결합 저해활성 뿐 아니라 5-LO에 대한 저해활성 가능성까지 고려하고 기존에 알려진 이들 저해제들의 구조를 참조할 때,17,18) hexane 가용분획으로 활성이 집중되는 지모 및 호미 초를 활성 성분의 연구대상으로 선정하였다.
- 지모와 호미초의 hexane 가용분획으로 부터 실리카겔 컬럼을 통하여 얻은 소분획 AA-4와 ES-4는 30ug/ml 농도에서 LTB4 수용체 결합 저해활성이 각각 78% 및 62%로서 매우 우수하였다. 이와 같은 결과들로부터 생약 추출물의 활성 추적과정을 통하여 새로운 골격의 LTB4 수용체 저해제를 찾고 LTB4의 활성을 차단함으로써 소염 및 천식의 치료에 활용할 수 있는 물질의 도출이 가능할 것으로 기대된다.
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