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문제 정의
- 본 연구에서는 여성들의 통경약으로도 사용되는 옻이 자궁경부암 바이러스인 파필로마바이러스 암 유발인자 E6와 E7의 작용을 억제하는 효과를 확인하고 항 바이러스, 암 활성능의 기작을 이해하기 위하여 이들 추출물의 자궁암 세포주에 대한 세포독성과 암을 일으키는 바이러스 발암유전자 E6와 E7의 작용에 미치는 효과를 조사하였다.
제안 방법
- 9 mg/mL)는 lOOjiL로 첨가하였으며, Rhus(100 gg/ mL)는 1/63- dilution하여 즉 200μL를 첨가하여 결합시켰는데 결합 과정과 SDS-RkGE sample 제조 방법은 Yang 등5)의 방법과 동일하게 실시하였다. 3번의 wash 가 끝나면 상등액을 완전히 제거 후 중류수 50μL와 5XSDS sample buffer 12 μL 을 넣어 SDS-FAGE sample을 제조하였다. Samplee 10μL씩 loading 하여 25 mA로 전기영동 후 staining 하였으며 , Westerne 15μL씩 loading하여 전기영동을 실시한 g하을 Immobilon- P membrane으로 transfer한 후 anti-Rb antibody(Ab-6) (Oncogene, Cambridge, MA) (monoclonal mouse IgG, 100|ig/mL)를 1차 처리하고 anti-mouse IgG(r- chain specific) alkaline phosphate conjugate(Sigma- Aldrich Chem.
- 9 mg/ mL) 싱등액 500 |1L에 GSH bead 500 pL을 결합 시켜 이를 Bead GST/E7으로 사용하였다. Bead GST/E7과 pET/Rb의 결합 Assay는 PBST를 Total Volum을 1200 μL로 하여 Bead GST/ E7은 각각 40μL, pET/Rb (6.9 mg/mL)는 lOOjiL로 첨가하였으며, Rhus(100 gg/ mL)는 1/63- dilution하여 즉 200μL를 첨가하여 결합시켰는데 결합 과정과 SDS-RkGE sample 제조 방법은 Yang 등5)의 방법과 동일하게 실시하였다. 3번의 wash 가 끝나면 상등액을 완전히 제거 후 중류수 50μL와 5XSDS sample buffer 12 μL 을 넣어 SDS-FAGE sample을 제조하였다.
- DMEM/10% FBS에 유지시킨 HPV 16 genome을 지니고 있는 자궁경부암세포주 CaSki를 100mm petridish에 5Xl05/10mL씩 넣은 후 1일 동안 CO2 incubator에 배양하였다. 새로운 배지로 갈아준 후 800 배 농도로 희석시킨 Rhus Ⅰ과 Ⅱ를 처리한 20시간 후 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.
- HPV type 16 과 18의 E6/E7은 human genital keratinocytes 의 효율적인 immortalization에 밀접한 관련이 있다(17). Fig. 1 에서 보듯이 HPV 양성 세포주에 Rhus의 효과가 가장 높았기 때문에 HPV의 2개의 발암유전자인 E6 및 E7 와 세포 내의 단백질 즉 E6-AP 및 Rb의 결합 및 그들의 발현 조절에 Rhus가 미치는 영향을 조사했다.
- GST결합형태로 제조되었다. HPV 함유 자궁 경부암 세포인 CaSk의 RNA로부터 다음과 같은 primer(5'- CAC CAT GGC ATG GCA TGG AGA TAC ACCT-3과 5'-TIA TGG TIT CTG AGA ACA-3')를사용하여 RT-PCR를 수행 중폭하였다. 이 중폭산물을 T-vectoi에 연결하고 다시 BamH I과 Sal I로 절단하여 E7 유전자를 얻는다.
- E6는 HPV 함유 자궁경부암 세포로부터 추출한 RNA 로부터 5-GCG GCC GCC ACC ATG TTT CAG GAC CAC AG-3, (sense) and 5'- CTG CGG CCG CGA TIA CAG CTG GGT TTT CTC T-3, (antisense)의 primer를 사용하여 역전사 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하여 중폭하였다. PCR 산물을 pBluescript Ⅱ KS(+)로 제조된 T- vector(13)에 옮긴 후 이 E6 유전자를 다시 제한효소 BamH I 과 Sal I로 절단하고 똑같은 효소로 절단한 PGEX4T-1 과 pET28a벡터로 연결하였다. 또한 E&AP는 중간 부분이 중복되는 2종류의 primer set(5'-AGA TCT ATG AAG CGA GCA GCT GCA AAG CAT CIA ATA-3, 과 5'-CTC TAG CCG GAC AAG TGC ATC ATC TAT GAT-3', 5-AGC GAG CTG ACA CTT CAG GAA CTT TTG GGA-3, 과 5'-TIA CAG CAT GCC AAA TCC TTT GGC ATA CGT-3')를 사용하여 앞에서와 같은 방법으로 RTPCR로 중폭하였다.
- 즉 PBST 750μL에 Bead GST/E6AP 50 μL, His E6 상등액 200μL, Rhus 200兀(100μL/mL)을 넣어 결합 시켰으며 결합 과정과 SDS-PAGE sample 제조 방법은 대조구(Bead GST/E6AP과 His E6결합) 와동일하게 실시하였다. Samplee 10μL씩 loading 하여 25 mA로 전기영동 후 Coomasie blue로 염색하였으며, Western 은 15 gL 씩 loading 한 gel 을 Immobilon-P memebrane 으로 transfer 한 후 HPV 16-E6(N-17) antibody(goat polyclonal IgG, Santa Cruze Biotechology, Santa Cruz, CA)을 1차 처리하고 Antigoat IgG(H+L)- alkaline phosphatase(Sigma)를 2차 처리하여 확인하였다.
- 3번의 wash 가 끝나면 상등액을 완전히 제거 후 중류수 50μL와 5XSDS sample buffer 12 μL 을 넣어 SDS-FAGE sample을 제조하였다. Samplee 10μL씩 loading 하여 25 mA로 전기영동 후 staining 하였으며 , Westerne 15μL씩 loading하여 전기영동을 실시한 g하을 Immobilon- P membrane으로 transfer한 후 anti-Rb antibody(Ab-6) (Oncogene, Cambridge, MA) (monoclonal mouse IgG, 100|ig/mL)를 1차 처리하고 anti-mouse IgG(r- chain specific) alkaline phosphate conjugate(Sigma- Aldrich Chem. Gmbh)를 2차 처리하여 확인하였다.
- PCR 산물을 pBluescript Ⅱ KS(+)로 제조된 T- vector(13)에 옮긴 후 이 E6 유전자를 다시 제한효소 BamH I 과 Sal I로 절단하고 똑같은 효소로 절단한 PGEX4T-1 과 pET28a벡터로 연결하였다. 또한 E&AP는 중간 부분이 중복되는 2종류의 primer set(5'-AGA TCT ATG AAG CGA GCA GCT GCA AAG CAT CIA ATA-3, 과 5'-CTC TAG CCG GAC AAG TGC ATC ATC TAT GAT-3', 5-AGC GAG CTG ACA CTT CAG GAA CTT TTG GGA-3, 과 5'-TIA CAG CAT GCC AAA TCC TTT GGC ATA CGT-3')를 사용하여 앞에서와 같은 방법으로 RTPCR로 중폭하였다. 이중폭된 산물을 pGEX4T-l와 pET28a에서 발현하였다(14)
- GST/E6, GST/ E7, GST/E6-AJ는 PBS 완충용액으로 미리 평형화시킨 GSH bead에 결합시키고 같은 완충용액으로 씻어 주었다. 또한 pET28a/E6, pET28/E7 과 pET28/E6-AP의 경우 Ni-NIA bead에 결합시키고 20 mM imidazole이 포함된 완충용액으로 3번 씻어낸 후 결합반응을 실시하였다.
- 배양하였다. 새로운 배지로 갈아준 후 800 배 농도로 희석시킨 Rhus Ⅰ과 Ⅱ를 처리한 20시간 후 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. E6 primers는 5GCGGCCGCCACCATGTTTCAGGACCAC AG-3'(sense), 5'-CTGCGGCCGCGATIACAGCTGGGT TTTCTCT3(antisense>와 같이 하였으며, E7 primers는 5-GCGGCCGCCACCATGGCArGGCArGGAGATACA CCT-3'(sense), 5'-AGGCGGCCGCGATTATGGTTTCTG AGAACA-3, (antisense)로 하였다.
- 배양하였다. 새로운 배지로 갈아준 후 여러 가지 농도로 희석시킨 Rhus 1과 H를 처리한 후 20시간 후 WST-1 (Roche Diagnostic GmbH, Germany) 10gL< 첨가하여 1-3시간 이내에 450nm에서 흡광도를 ELISA reader(Molecular Device, CA)로 측정하였다.
- coli(DH5a), pET28a 발현 벡터는 BL21 (入DE3)에 transformation시키고 1 mM iso- prophyl-p-D-thiogalactopyranoside(IPTG) 첨가하고 18℃에서 12시간동안 단백질을 유도하였다. 숙주세균을 원심분리하여 얻었고 pGEX 및 pET/Rb 발현대장균은 phosphate-buffered saline(0.5% Triton X-100, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluride(PMSF)와 10μg/mL 의 aprotinin 함유) PBST에 pET28 발현 대장균은 용해 완충용액 (50mM NaH2PO4, 150 mM NaCl)에 현탁시키고 초음파 파쇄를 실시하였다. 이를 원심분리하고 상등액만을 취하여 결합 반응에 사용하였다.
- 인두유종 바이러스(HPV) 16형 및 18형과 자궁경부암과의 긴밀한 관련성은 잘 알려져 있다. 옻 추출물 Rhus가 HPV 16형의 E6, E7 발암 유전자를 억제하는지 여부를 측정하였다. 이 Rhus는 자궁경부암 세포주(C-33A, SiHa, Caski)와 HaCaT keratinocytes의 분열은 농도 의존적으로 억제하였다.
- 재조합 단백질 대량생산 및 bead 에 부착: pET/Rb, pGEX 발현 벡터는 E. coli(DH5a), pET28a 발현 벡터는 BL21 (入DE3)에 transformation시키고 1 mM iso- prophyl-p-D-thiogalactopyranoside(IPTG) 첨가하고 18℃에서 12시간동안 단백질을 유도하였다. 숙주세균을 원심분리하여 얻었고 pGEX 및 pET/Rb 발현대장균은 phosphate-buffered saline(0.
- Rhus는 1/6 diliution하여 첨가하였다. 즉 PBST 750μL에 Bead GST/E6AP 50 μL, His E6 상등액 200μL, Rhus 200兀(100μL/mL)을 넣어 결합 시켰으며 결합 과정과 SDS-PAGE sample 제조 방법은 대조구(Bead GST/E6AP과 His E6결합) 와동일하게 실시하였다. Samplee 10μL씩 loading 하여 25 mA로 전기영동 후 Coomasie blue로 염색하였으며, Western 은 15 gL 씩 loading 한 gel 을 Immobilon-P memebrane 으로 transfer 한 후 HPV 16-E6(N-17) antibody(goat polyclonal IgG, Santa Cruze Biotechology, Santa Cruz, CA)을 1차 처리하고 Antigoat IgG(H+L)- alkaline phosphatase(Sigma)를 2차 처리하여 확인하였다.
- Reverse transcription- polymerase chain reaction(RT-PCR) 은 RT-PCR kit (Stratagene)를 이용하여 수행하였다. 즉, cDNA는 50μL 반응액 [5 μL 10X first-strand buffer, 1μL RNase block ribonuclease inhibitor(40 U/μL), 2μL 100 mM dNTPs, 1 μL MMLV-RT (50U/μL)}을 37℃에서 1시간 반응 시켜 얻은 다음, primer와 함께 중합반웅을 계속시켜(30 cycles: 1 min at 95℃, 1 min at 57℃ and 1 min 30 sec at 72℃) PCR products를 얻어 1% agarose gel로 확인하였다. P-actin primer는 다음과 같았다: 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-31 (sense), 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'(antisense).
대상 데이터
- Bead GST/E7의 제조에 사용된 Bead GSH는 전 항목에서 제조한 Bead를 사용하였으며, GST/E7(13.9 mg/ mL) 싱등액 500 |1L에 GSH bead 500 pL을 결합 시켜 이를 Bead GST/E7으로 사용하였다. Bead GST/E7과 pET/Rb의 결합 Assay는 PBST를 Total Volum을 1200 μL로 하여 Bead GST/ E7은 각각 40μL, pET/Rb (6.
- E6와 E6-AP 발현 백터 제조: 본 실험에서 사용되는 E6와 E6-AI는 pGEX 및 pET 벡터에서 발현되도록 제조하였다. E6는 HPV 함유 자궁경부암 세포로부터 추출한 RNA 로부터 5-GCG GCC GCC ACC ATG TTT CAG GAC CAC AG-3, (sense) and 5'- CTG CGG CCG CGA TIA CAG CTG GGT TTT CTC T-3, (antisense)의 primer를 사용하여 역전사 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하여 중폭하였다.
- 이를 같은 제한효소로 절단한 PGEX4T-1 과 pET28a에 각각 연결하여 E7을 발현시켰다. E7과 결합하는데 이용되는 Rb 단백질은 Dr. Cho,YJ(Korea Institute of Science and Ibchnology, Seoul,Korea)로 부터 제공받았는데 이는 pET 벡터에서 제조되었으며 용해성과 안정성을 중가시키기 위한 pocket domain을 포함한 아미노산 373에서 928에 이르는 짧은 단백질이다.
이론/모형
- E6 primers는 5GCGGCCGCCACCATGTTTCAGGACCAC AG-3'(sense), 5'-CTGCGGCCGCGATIACAGCTGGGT TTTCTCT3(antisense>와 같이 하였으며, E7 primers는 5-GCGGCCGCCACCATGGCArGGCArGGAGATACA CCT-3'(sense), 5'-AGGCGGCCGCGATTATGGTTTCTG AGAACA-3, (antisense)로 하였다. Reverse transcription- polymerase chain reaction(RT-PCR) 은 RT-PCR kit (Stratagene)를 이용하여 수행하였다. 즉, cDNA는 50μL 반응액 [5 μL 10X first-strand buffer, 1μL RNase block ribonuclease inhibitor(40 U/μL), 2μL 100 mM dNTPs, 1 μL MMLV-RT (50U/μL)}을 37℃에서 1시간 반응 시켜 얻은 다음, primer와 함께 중합반웅을 계속시켜(30 cycles: 1 min at 95℃, 1 min at 57℃ and 1 min 30 sec at 72℃) PCR products를 얻어 1% agarose gel로 확인하였다.
성능/효과
- 3). Fig. 3의 A에서 볼 수 있듯이 in vitm 결합에서는 Rhus를 1.25%(15|1L) 이상 첨가하였을 때 확실한 억제효과를 나타내었고, B의 ELISA에서는 in vitm 결합처럼 확실한 억제 효과를 나타낸 것은 아니지만 유의성 있는 억제 효과를 볼 수 있었다. 또한 Rhus Ⅰ과 Rhus Ⅱ끼리 비교하였을 때 in vitm 결합과 ELISA 에서 동일하게 Rhus Ⅱ가 억제 효과를 나타내었는데 E6AP와 His E6의 in vitm 결합과 ELISA보다는 약하지만 결합 억제효과를 나타내었다.
- 1). Rhus Ⅱ 에 비해 Rhus Ⅰ의 세포독성이 강했고 HPV 유전자를 60-600 copy를 내포하고 있는 CaSki 세포주에서 가장 두드러졌다. Rhus Ⅰ의 세포독성은 CaSki, SiHa, HaCaT, C-33A 순으로 영향을 받았다.
- Rhus가 E6, E7 mRNA에 미치는 영향을 보기위해 RTPCR을 수행한 결과 Rhus가 HPV oncogene인 E6와 E7의 mRNA를 저해하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4). Fig.
- Rhus가 E7과 Rb의 결합에 미치는 영향을 보기위해 in vitm 결합과 ELISA< 수행한 결과 Rhu가 E7과 Rb의 결합을 농도의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3). Fig.
- Rhu가 E6AP와 E6의 결합에 미치는 영향을 보기 위해 in vitro 결합과 ELISA를 수행한 결과 Rhus가 E6AP와 E6의 결합을 농도 의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). Fig.
- 4로 CaSki Cells에서도 800배로 Rhus를 처리 하였을 때 mRNA level이 저해됨을 확인할 수 있었다. 결론적으로 옻(Rhu아은 E6의 전사를 감소시키고 또한 E6-E6AP 및 E7-Rb 결합반응을 방해함으로서 세포의 불멸화에 필요한 세포내의 단백질의 변화를 억제함으로써 HPV 양성인 자궁경부암 세포에 특이적으로 독성을 나타낼 수 있다. 옻에 어떤 성분이 또 어떤 인자가 이런 기작을 일으키는지에 관한 체계적이고 과학적인 연구는 아직 시행되고 있지 아나았다.
- 25%(15|1L) 이상 첨가하였을 때 확실한 억제효과를 나타내었고, B의 ELISA에서는 in vitm 결합처럼 확실한 억제 효과를 나타낸 것은 아니지만 유의성 있는 억제 효과를 볼 수 있었다. 또한 Rhus Ⅰ과 Rhus Ⅱ끼리 비교하였을 때 in vitm 결합과 ELISA 에서 동일하게 Rhus Ⅱ가 억제 효과를 나타내었는데 E6AP와 His E6의 in vitm 결합과 ELISA보다는 약하지만 결합 억제효과를 나타내었다. Rhus의 자궁 경부암의 독성 및 E7의 결합능을 억제하는 정확한 기작은 알려지지 않았다.
- 자궁경부암 세포주 C-33A, Caski, SiHa와 HaCaT keratinocytes에 RhusⅠ, Ⅱ를 희석배율 1000배 까지 처리한 결과 Caski 세포주에서 800배부터 가장 민감한 세포독성을 보여 세포의 성장이 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 자궁경부암 세포주 중에서도 HPV가 아닌 다른 원인에 의해 암 세포화된 C-33A의 경우 800배에서도 세포독성이 나타나지 않았으나 500배 이상의 농도에서는 모든 세포주들의 성장이 거의 멈추어 졌다(Fig.
후속연구
- E7단백질도 E6와 같이 Zn-finger 구조를 가지고 있어 Rhus가 Zn-finger 구조로부터 Zn를 방출하거나 구조를 불활성할 수도 있을 것이라 추정할 수 있다. 그러나 Rhus의 화학적 구조라든지 작용은 아직 보고된 바 없어 억제 효과의 기전은 앞으로 더 연구해야 할 과제이다.
- RT-PCR에 의하면 Rhus에 의해 E6 mRNA의 level 이 감소하였으나 E7 mRNA는 변하지 않았음을 보여주었다. 이들 결과에 의하면 Rhus가 HPV 16형의 E6 와E7의 발암성을 억제함을 보여주므로 HPV에 의해 유도된 자궁경부암의 치료에 유효할 것으로 사료되어 좀 더 자세한 in Wmx실험 등이 요구된다.
- 한편 인체에 발생하는 전체 암의 15~20%가 바이러스와 연관되어 있는 것으로 이미 밝혀져 있어 원인 바이러스를 분리하거나 분리된 바이러스의 DNA로부터 단백질을 만들어내어 백신으로 사용하거나 진단법에 이용하는 연구가 이루어지고 있다. 이들에 관한 연구는 종양바이러스에 의해 유도되는 암의 발암기작을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 아직까지 그 주요 원인을 모르는 타종 암에 대하여도 많은 정보를 제공할 수 있을 것이다. 일례로 SV40바이러스의 large T antigen과 HPV E6 단백질은 p53 단백질의 기능을 억제하고 있음이 밝혀졌는데(10) 정상적으로 p53을 나타내는 세포에 HPV E6 발현을 유도하면 세포중식이 촉진되고 있음이 밝혀졌다(11) 단백질은 대부분의 암 조직에서 유전자 돌연변이에 의해 발현이 안되거나 그 기능이 상실되어 있으며 암의 종류에 따라 돌연변이의 형태도.
- 또한 이 성분은 알러지를 일으키지 않을 뿐 아니라 항암효과 이외에도 강한 항산화 작용 및 숙취 해소기능을 가지는 약제로서의 가능성이 크다고 보고하였다6>. 이런 결과로 보아 urushiol의 활성을 억제한 Rhus Ⅱ에는 E6 발암유전자의 작용을 억제하는 항암 효과성분이 들어있는 것으로 사료되며, 이들 항암 성분의 분리 정제 및 임상시험이 더욱 요구된다.
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