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문제 정의
- 본 연구에서는 멸치, 소금에 절인 멸치 및 발효된 멸치젓의 돌연변이 및 보돌연변이 유도 여부를 검토하기 위하여 생멸치, 생멸치에 소금(20%)을 첨가한 것, 6개월간 발효된 멸치젓 건더기 및 액, 12개월간 발효된 멸치액젓의 메탄올추출물을 시료로 Ames test 및 SOS chromotest를 하였다.
제안 방법
- 균주에 대한 시료의 독성유무를 살펴보기 위해서 실험에 사용하기 전에 독성실험을 행하여 독성이 나타나지 않는 범위 내에서 시료의 농도를 결정하였다. 먼저 멸균된 cap test tube에 top agar 2mL를 분주한 후, 균주 100 μL(l~2× 109 cells/mL)와 시료를 첨가하고 가볍게 교반한 후 nutrient agar plate에 분주, 고화시켜서 37℃에서 24시간 배양시킨 다음, 그 독성유무를 판정하였다.
- 동결건조시킨 각각의 시료를 마쇄하여 분말을 조제하고 분말시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복하여 여과한 후 회전식 진공 농축기로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다 메탄올추출물은 hexane : methanol(l : 1, v/v)으로 3회 추출하여 hexane fraction과, methanol soluble fraction으로 분획하였으며, 이들 추출물들은 멸균증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.
- 않는 범위 내에서 시료의 농도를 결정하였다. 먼저 멸균된 cap test tube에 top agar 2mL를 분주한 후, 균주 100 μL(l~2× 109 cells/mL)와 시료를 첨가하고 가볍게 교반한 후 nutrient agar plate에 분주, 고화시켜서 37℃에서 24시간 배양시킨 다음, 그 독성유무를 판정하였다.
- 멸치젓갈에서 돌연변이 유발물질, 및 활성물질을 찾기 위해서 멸치젓갈의 메탄올추출물을 hexane추출물과 methanol soluble iiaction(MSF)으로 나누어 SOS chromotest를 하였다(Table 7). 이 경우 젓갈에 사용되는 주요 침장원인 소금은 수용성물질로 MSF에 존재하며 hexane 추출물에는 지방산을 포함한 지용성 물질들이 남게된다.
- 시료에 함유된 histidine에 의해 영향을 받지 않는 SOS chromotes에서의 보돌연변이 효과를 살펴보기 위해 E. coli의 변이주인 PQ37을 이용하여 MNNG에 대한 보돌연변이 실험을 하였다. 먼저 멸치 및 멸치젓 메탄올추출물 자체의 돌연변이 유발성을 검토한 결과는 Table 5와 같다.
대상 데이터
- Salmonella typhimurium TA 100은 Salmonella typhimurium LT-2의 histidine 요구성 균주로서 미국 California대학의 B. N. Ames박사로부터 제공받아 정기적으로 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 돌연변이 유발물질인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)은 Aldrich ChemicalCo.
- 멸치젓 원료 및 발효된 멸치젓의 돌연변이 유도 여부를 관찰하기 위하여 생멸치, 생멸치에 소금(천일염)을 첨가한 것, 6개월간 발효된 멸치젓 건더기 및 액 그리고 12개월간 발효된 멸치액젓을 경남, 기장(대변)에서 구입하여 사용하였다. 생멸치는 크기가 12~15cm로 1998년 2월에 기장에서 잡은 것을 사용하였고, 6개월간 발효시킨 멸치젓갈은 1997년 9월에 잡은 멸치에 20% 소금을 첨가하여 1998년 2월까지 실온에서 발효시킨 것으로 어체와 액을 분리하여 각각 시료로 이용하였으며, 12개월간 발효시킨 멸치액젓은 1997년 3월에 잡은 멸치에 20%소금을 첨가한 후 1998년 2월까지 실온에서 발효한 다음 3번 여과하여 제품화 된 것을 사용하였다.
- 구입하여 사용하였다. 생멸치는 크기가 12~15cm로 1998년 2월에 기장에서 잡은 것을 사용하였고, 6개월간 발효시킨 멸치젓갈은 1997년 9월에 잡은 멸치에 20% 소금을 첨가하여 1998년 2월까지 실온에서 발효시킨 것으로 어체와 액을 분리하여 각각 시료로 이용하였으며, 12개월간 발효시킨 멸치액젓은 1997년 3월에 잡은 멸치에 20%소금을 첨가한 후 1998년 2월까지 실온에서 발효한 다음 3번 여과하여 제품화 된 것을 사용하였다.
데이터처리
- a-dMeans with the different letters in the same column are significantly different(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- a-fMeans with the different letters in the same column are significantly different(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- a-dMeans with the different letters in the same column are significantly different(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험자료로부터 ANOVA를 구한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 통계 분석하였다.
이론/모형
- Quillaniet의 방법을 변형시킨 백과 함(14)의 방법을 사용하였다. 냉동 보관된 E.
- 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 OD420값은 Milled(15)의 공식에 의해 enzyme unit(Eu)값을 구하였다.
성능/효과
- 05). 5 mg/plate 첨가농도에서 소금에 절인 멸치는 665±29, 6개월간 발효된 멸치젓의 건더기는 458±20, 액은 271±13, 12개월 발효된 액젓은 321±33개의 복귀돌연변이수를 나타내어 발효되면서 돌연변이 유발성이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 이 경우 젓갈에 사용되는 주요 침장원인 소금은 수용성물질로 MSF에 존재하며 hexane 추출물에는 지방산을 포함한 지용성 물질들이 남게된다. 50㎍/well과 100 ㎍/well 첨가농도에서 모두 소금에 절인 멸치의 MSF는 메탄올추출물보다 보돌연변이성이 높았다. 12개월간 발효시킨 멸치젓갈 역시 메탄올추출물은 항돌연변이 효과를 나타낸 반면 MSF는 항돌연변이효과를 나타내지 못했다.
- 12개월 된 멸치젓 시료는 멸치액젓을 동결건조하여 메탄올추출물을 제조하였으므로 많은 양의 소금을 함유하고 있다. MNNG에 의한 돌연변이 실험에서 소금과 histidine을 함께 첨가해 본 결과(Table 4), 12개월간 발효시킨 멸치액젓 2.5 mg에 함유된 천일염 1.4 mg과 histidine 8㎍은 2310±17개의 복귀돌연변이수를 나타내어 12개월간 발효시킨 멸치액젓(1140±29개)보다 2배 이상 높은 보돌연변이성을 보였다. 따라서 histidine의 함량이 높은 멸치젓갈의 안전성을 Ames test로만 판정하는 것은 바람직하지 못한 것으로 생각된다.
- MNNG와 함께 멸치 및 멸치젓의 메탄올추출물을 각 well 당 25~100㎍을 처리한 결과(Table 6), 25~100 ㎍ 처리시 생멸치 메탄올추출물은 각각 13, 35%의 돌연변이 유발 저해효과를 보였다. 그러나 소금을 첨가한 생멸치 메탄올추출물은 25㎍의 낮은 농도에서도 대조군(MNNG 처리군)과 같은 2.
- 유발 저해효과를 보였다. 그러나 소금을 첨가한 생멸치 메탄올추출물은 25㎍의 낮은 농도에서도 대조군(MNNG 처리군)과 같은 2.97의 SOS induction factor를 나타냈고 100㎍ 첨가농도에서는 3.67의 높은 SOS induction factor를 나타내어 소금의 첨가로 보돌연변이성이 높아짐을 확인할 수 있었다. 발효된 멸치젓 메탄올추출물은 25㎍ 첨가시 13-18%의 항돌연변이 효과를 보였으나 첨가농도가 100㎍으로 높아지면서 5-15%로 오히려 돌연변이 억제효과가 감소되었고, 또한 생멸치(35%)보다 낮은 돌연변이 유발 억제 효과를 보였다.
- 따라서 12개월간 발효시킨 멸치젓갈의 hitidine함량을 측정한 결과 12개월간 발효시킨 멸치젓갈 메탄올 추출물 5000㎍에는 16㎍의 histidine이 함유되어 있었다. Ames test에서 histidine이 돌연변이유발에 미치는 영향을 살펴본 결과(Table 3), histidine 자체로도 농도의존적으로 돌연변이를 증가시켜 32 ㎍/plate 농도에서는 자연복귀돌연변이 수의 2배정도의 복귀돌연변이수를 나타내었다.
- 따라서 멸치젓갈 제조시 멸치에 소금이 첨가되어(생젓갈) 돌연변이 유발이 일어날 수 있지만 숙성기간이 길어지면(12개월, 익은 젓갈) 오히려 항돌연변이 효과가 있는 것으로 나타났다. 충분히 발효된 젓갈은 김치나 그 외 음식물에 첨가, 사용되어도 그 안전성에는 문제가 없을 것으로 보여지며, 젓갈의 안전성과 기능성에 관한 in vivo 실험과 hexane층 내에 존재하는 기능성 물질 및 그 기작에 대한 추가연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- Ames test에서 histidine이 돌연변이유발에 미치는 영향을 살펴본 결과(Table 3), histidine 자체로도 농도의존적으로 돌연변이를 증가시켜 32 ㎍/plate 농도에서는 자연복귀돌연변이 수의 2배정도의 복귀돌연변이수를 나타내었다. 또한 histidine을 MNNG와 함께 처리하였을 때 12개월간 발효시킨 멸치젓갈보다는 낮으나 유의적으로 보돌연변이 유발성이 있었다(p<0.05). 12개월 된 멸치젓 시료는 멸치액젓을 동결건조하여 메탄올추출물을 제조하였으므로 많은 양의 소금을 함유하고 있다.
- 05). 모든 첨가농도에서 발효된 멸치젓이 생멸치나 소금에 절인 멸치보다 높은 보돌연변이 유발성을 보였으나, 12개월간 발효시킨 멸치젓갈이 6개월간 발효시킨 멸치젓갈보다 유의적으로 낮은 보돌연변이성을 나타내었다 (p<0.05).
- 67의 높은 SOS induction factor를 나타내어 소금의 첨가로 보돌연변이성이 높아짐을 확인할 수 있었다. 발효된 멸치젓 메탄올추출물은 25㎍ 첨가시 13-18%의 항돌연변이 효과를 보였으나 첨가농도가 100㎍으로 높아지면서 5-15%로 오히려 돌연변이 억제효과가 감소되었고, 또한 생멸치(35%)보다 낮은 돌연변이 유발 억제 효과를 보였다. 따라서 첨가되는 소금 농도가 높아지면 β-galactosidase의 활성이 높아져 보돌연변이를 유발한 것으로 보인다.
- 25 mg/plate 첨가농도부터 돌연변이성 이 높아지기 시작하여 5 mg/plate첨가농도에서는 311±13개의 복귀돌연변이 수를 나타내었다. 생멸치에 20%의 소금을 첨가한 시료의 경우는 2.5 mg/plate와 5 mg/plate 첨가농도에서 각각 생멸치 메탄올추출물보다 2배 이상 많은 556±21, 665±29개의 복귀돌연변이 수를 나타내어 생멸치에 소금이 첨가되면 유의적으로 돌연변이가 더 많이 유발됨을 관찰할 수 있었다(p<0.05). 5 mg/plate 첨가농도에서 소금에 절인 멸치는 665±29, 6개월간 발효된 멸치젓의 건더기는 458±20, 액은 271±13, 12개월 발효된 액젓은 321±33개의 복귀돌연변이수를 나타내어 발효되면서 돌연변이 유발성이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(p<0.
- 05). 소금에 절인 멸치 메탄올추출물은 0.625mg/plate 첨가농도에서는 512±18개의 복귀돌연변이 수를 나타내어 보돌연변이성을 나타내지 않았으나, 2.5mg/plate 첨가농도에서는 981±44개의 많은 복귀돌연변이수를 나타내어 생멸치에 소금을 첨가했을 때 유의적으로 보돌연변이 유발이 촉진됨을 관찰할 수 있었다(p<0.05). 모든 첨가농도에서 발효된 멸치젓이 생멸치나 소금에 절인 멸치보다 높은 보돌연변이 유발성을 보였으나, 12개월간 발효시킨 멸치젓갈이 6개월간 발효시킨 멸치젓갈보다 유의적으로 낮은 보돌연변이성을 나타내었다 (p<0.
- 보였다. 한편 12개월간 발효한 멸치액젓이 6개월간 발효한 멸치액젓 보다 높은 항돌연변이 효과를 나타내었으며, 충분히 발효되지 않은 멸치젓갈의 경우 소금에 의한 보돌연변이가 유발될 수 있다고 하였다.
후속연구
- 따라서 멸치젓갈 제조시 멸치에 소금이 첨가되어(생젓갈) 돌연변이 유발이 일어날 수 있지만 숙성기간이 길어지면(12개월, 익은 젓갈) 오히려 항돌연변이 효과가 있는 것으로 나타났다. 충분히 발효된 젓갈은 김치나 그 외 음식물에 첨가, 사용되어도 그 안전성에는 문제가 없을 것으로 보여지며, 젓갈의 안전성과 기능성에 관한 in vivo 실험과 hexane층 내에 존재하는 기능성 물질 및 그 기작에 대한 추가연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
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