불와전 균류인 Fusarium s^g pp.를 이용하여 여러 가지 배양조건과 생리적 영향에 따른 균주의 성장 및 T-2 toxin의 생성에 관하여 고찰하였다. T-2 toxin 의 검출방법은 thin layer chromatography (TCL) 법과 미생물학적 검출방법을 사용하였다. 고체 배지의 경우 횐옥수수 가루(Quaker사 제품)베지에서 다른 곡물보다 많은 양의 T-2 toxin이 생성되었으며,비교적 깨끗한 T-2 toxin이 정제되었다. 이 경우 배지 100g당 약 700 mg의 T-2 toxin이 생성되었으며, 그중 약 30%정도가 깨끗한 결정으로 정제되었다. 고온(20-$25^{\circ}C$)에서는 생장은 많았으나, T-2 toxin의 생성은 적었으며, 저온(10-$15^{\circ}C$)에서는 비교적 생장이 적었지만, T-2 toxin의 생성이 많았고, 젖당, 글리세롤, 솔비톨의 경우는 적었다. 유일 탄소원으로 구연산과 초산은 이용하지 못하였으며, 녹발의 경우 생장은 많았으나 T-2 toxin의 생성양은 적었다. 질소원의 경우 $NaNO_2$를 제외하고는 $(NH_4)_2NO_4$, $NH_4Cl_3$, $NH_4NO_3$, $KNO_3$ 를 거의 동일하게 이용하였다. 초기 pH값에 생성과 균주의 성장은 pH4.0-5.0일 경우 최적을 나타냈으며 ph6.0이상에서는 성장도 저하되고, T-2 toxin생성도 적었다. 회전속도에 따른 T-2 toxin 생성과 균주의 성장을 보면 회전속도가 속돠 증가함에 따라 균주의 생장과 T-2 toxin 생성량이 모두 증가하였다. $15^{\circ}C$에서 7일간 배양 후, $25^{\circ}C$로 옮겨 7일간 배양하여, toxin의 생성을 보면, $15^{\circ}C$에 7일간 배양했을 때보다 T-2 toxin양이 적었다. 이는 생성되었던 T-2 toxin이 분해되었음을 보여주는 것이다. 이상의 결과를 볼 때 T-2 toxin 대사 경로는 온도에 의한 효소 억제 또는 효소 유지 시스템에 의해 조절되는 것이라고 생각할 수 있다.
불와전 균류인 Fusarium s^g pp.를 이용하여 여러 가지 배양조건과 생리적 영향에 따른 균주의 성장 및 T-2 toxin의 생성에 관하여 고찰하였다. T-2 toxin 의 검출방법은 thin layer chromatography (TCL) 법과 미생물학적 검출방법을 사용하였다. 고체 배지의 경우 횐옥수수 가루(Quaker사 제품)베지에서 다른 곡물보다 많은 양의 T-2 toxin이 생성되었으며,비교적 깨끗한 T-2 toxin이 정제되었다. 이 경우 배지 100g당 약 700 mg의 T-2 toxin이 생성되었으며, 그중 약 30%정도가 깨끗한 결정으로 정제되었다. 고온(20-$25^{\circ}C$)에서는 생장은 많았으나, T-2 toxin의 생성은 적었으며, 저온(10-$15^{\circ}C$)에서는 비교적 생장이 적었지만, T-2 toxin의 생성이 많았고, 젖당, 글리세롤, 솔비톨의 경우는 적었다. 유일 탄소원으로 구연산과 초산은 이용하지 못하였으며, 녹발의 경우 생장은 많았으나 T-2 toxin의 생성양은 적었다. 질소원의 경우 $NaNO_2$를 제외하고는 $(NH_4)_2NO_4$, $NH_4Cl_3$, $NH_4NO_3$, $KNO_3$ 를 거의 동일하게 이용하였다. 초기 pH값에 생성과 균주의 성장은 pH4.0-5.0일 경우 최적을 나타냈으며 ph6.0이상에서는 성장도 저하되고, T-2 toxin생성도 적었다. 회전속도에 따른 T-2 toxin 생성과 균주의 성장을 보면 회전속도가 속돠 증가함에 따라 균주의 생장과 T-2 toxin 생성량이 모두 증가하였다. $15^{\circ}C$에서 7일간 배양 후, $25^{\circ}C$로 옮겨 7일간 배양하여, toxin의 생성을 보면, $15^{\circ}C$에 7일간 배양했을 때보다 T-2 toxin양이 적었다. 이는 생성되었던 T-2 toxin이 분해되었음을 보여주는 것이다. 이상의 결과를 볼 때 T-2 toxin 대사 경로는 온도에 의한 효소 억제 또는 효소 유지 시스템에 의해 조절되는 것이라고 생각할 수 있다.
The cultural and physiological conditions for the T-2 toxin [4,15-diacetoxy-8-(3-mety1butyloxy)-12,13- epoxy-trichothec-9-en-3-01, $C_{24}H_{30}O_9$] production by Fusarium spp. were studied. Thin layer chromatography (TLC) assay and the microbiological assay uslng Rhodotomla rubra were u...
The cultural and physiological conditions for the T-2 toxin [4,15-diacetoxy-8-(3-mety1butyloxy)-12,13- epoxy-trichothec-9-en-3-01, $C_{24}H_{30}O_9$] production by Fusarium spp. were studied. Thin layer chromatography (TLC) assay and the microbiological assay uslng Rhodotomla rubra were used to quantitate tbe T- 2 toxin. Among the four strains of Fusarium spp., F tn'cinctum NRRL 3299 was best for T-2 toxin production. In solid culture, white com grit medium was best for T-2 toxm production. Temperature played a critical role in the production of T-2 toxin. T-2 toxin production was favored by long duration of low-temperature incubation. The growth and toxin production were relatively high on galactose, fructose, glucose, and sucrose media, when each was used as a sole carbon source, and relatively low on sorbitol, glycerol, and lactose media. For nitrogen sources, $NH_4^(+) and NO_3^{-}were used well as a sole nitrogen source, but $NO_2^-$ was not used. Initial pH and speed of shaker also affected the production of T-2 toxin. From temperature shifting experiment, it is clear that T-2 toxin metabolic pathway is regulated by temperature-dependent enzyme depression or enzyme induction system.
The cultural and physiological conditions for the T-2 toxin [4,15-diacetoxy-8-(3-mety1butyloxy)-12,13- epoxy-trichothec-9-en-3-01, $C_{24}H_{30}O_9$] production by Fusarium spp. were studied. Thin layer chromatography (TLC) assay and the microbiological assay uslng Rhodotomla rubra were used to quantitate tbe T- 2 toxin. Among the four strains of Fusarium spp., F tn'cinctum NRRL 3299 was best for T-2 toxin production. In solid culture, white com grit medium was best for T-2 toxm production. Temperature played a critical role in the production of T-2 toxin. T-2 toxin production was favored by long duration of low-temperature incubation. The growth and toxin production were relatively high on galactose, fructose, glucose, and sucrose media, when each was used as a sole carbon source, and relatively low on sorbitol, glycerol, and lactose media. For nitrogen sources, $NH_4^(+) and NO_3^{-}were used well as a sole nitrogen source, but $NO_2^-$ was not used. Initial pH and speed of shaker also affected the production of T-2 toxin. From temperature shifting experiment, it is clear that T-2 toxin metabolic pathway is regulated by temperature-dependent enzyme depression or enzyme induction system.
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문제 정의
T-2 toxme 무색결정체로서 chloroform이나 acetone 같은 유기용매에 잘 녹으며, 물이니-, 헥산, petroleum ether 같은 용매에는 녹지 않으며, 화학물질과 열에 상대적으로 안정적이다 T-2 tox은 곡물 수확 후 겨울 저장기간 동안 생성되어 많은 사람 및 동물에 피해를 주고있는 독소로서 그 중요성이 대두되어 왔다. 본 논문에서는 T-2 toxin의 분리 및 검색 방밥이 정립되었으며 독소생성의 여러 배양 및 생리적 조건들의 연구되었다.
이 연구에서는 고체배지는 최적 T-2 toxin 생성조건 및 고순도 의 독소 분리방법의 정립읖 위해 실행되었으며, 액체배지는 T-2 toxin 생성에 미치는 생리적, 환경적 영향을 조사하기 위해 시행되었다. 4종의 균주중에서 R triemetum NRRL 3299이 다른 균주에 비해 가장 많은 양의 T-2 toxin을 생성하였으며, 이 균주는 여러 고체배지 및 Richard solution에서도 잘 자랐다.
제안 방법
Fusarh의 Conidia는 균주를 YM agar slant에서 25℃에서 14 일 간 배양하여 만들었다 배지상의 Conidia를 접종 루프로 잘 긁어내어, 10 의 멸균한 증류수에 탁할 정도의 농도가 되게 수용액을 만들었다. 고체배지의 경우, 4.
1 mm 크기의 원판을 Whatman 여과지로 만들어, 독소 표준묨액과 샘플을 원판에 적용하여 70。<2에서 30 분 간 건조시켜 사용하였다. Rhodotoi-ula rubra NRRL Y- 7222를 YM agar slant에 25에서 48 시간 동안 배양하여 slant 를 긁어서 세포수용액을 만들었다. 그리고 이 수용액을 YM broth에 600 에서 optical density가 0.
Richards solution에서 설탕 대신에 다른 탄소원을 넣어 각종 탄소원이 T-2 toxin 생성에 미치는 영향을 조사하였다{Table 4). 갈락토오스, 과당, 설탕, 포도당의 경우 생장도 많았고, 비교적 T-2 tox의 생성도 많았으나, 젖당, 글리세롤, 솔비톨의 경우는 적었다.
TLC 판 (silica gel 60F, Merck Co)을 2x8 cm (넓이x길이)로 잘라 사용하였다. T-2 toxin을 아세톤에 녹여 표준 독소 욤액을 만든 후(1 mglml), 0, 2, 5, 10, 15, 20 ㎍ 상당의 용액을 마이크로피펫을 이용하여 TLC판에 적용했다. TLC판은 tolueneethylacetate (1:3 v/v) 용액으로 처리하였고, 공기중에서 건조 후, color developing solution (675 ml ethanol, 18.
T-2 toxine yeast인 R rubra NRRL Y- 7222의 성장을 저해한다. YM agar에서 T-2 toxin 농도에 따른 R m의 성장 저해를 측정하였다. T-2 toxin 농도 4에서 12 jl/g 사이에서 T-2 toxin 농도와 R.
이후 건조하여 열판 위에서 구웠다. 샘플의 독소의 양은 표준판의 독소 밴드의 크기와 검기를 비교하여 결정하였다. 실험은 최소 3번 반복하였다.
위에서 만든 원판을 아가 배지 위에 놓은 후, 25에서 40 시간 배양하였다. 표준 독소와 샘플의 성장 저해구역을 비교하여 샘플의 독소 양을 결정하였다. 실험은 최소 3번 반복하였다.
대상 데이터
Fusaviwn tiicmchim NRRL 5299, Fusanum tricinctum T-340, Fusarium tricmctum T-341, and Fusarium sporotrichoides T-2 등이 연구에 시용되었다. 균주들은 Yeast-Malt (YM) agar slant에 252에서 7일간 키운 후 냉장고에 보관하였다.
TLC 판 (silica gel 60F, Merck Co)을 2x8 cm (넓이x길이)로 잘라 사용하였다. T-2 toxin을 아세톤에 녹여 표준 독소 욤액을 만든 후(1 mglml), 0, 2, 5, 10, 15, 20 ㎍ 상당의 용액을 마이크로피펫을 이용하여 TLC판에 적용했다.
미생물학적 검색 방범은 Burmcistei과 Hesseltine의 방법을 따랐다(3). 간략히, 지름 12.
차별 용매주줄(differential solvent extraction) 방법으로 T-2 toxin을 정제하였다(2).
성능/효과
이 연구에서는 고체배지는 최적 T-2 toxin 생성조건 및 고순도 의 독소 분리방법의 정립읖 위해 실행되었으며, 액체배지는 T-2 toxin 생성에 미치는 생리적, 환경적 영향을 조사하기 위해 시행되었다. 4종의 균주중에서 R triemetum NRRL 3299이 다른 균주에 비해 가장 많은 양의 T-2 toxin을 생성하였으며, 이 균주는 여러 고체배지 및 Richard solution에서도 잘 자랐다. Richard solutione 성장요소들 (growth factors)을 함유하지 않는 인조배지이다.
갈락토오스, 포도당, 설탕, 과당 등은 성장에 좋은 탄소원이었고, T-2 toxin 생성도 많았다. 동위원소로 표식된 초산 및 메 발론산의 경우, 이들이 T-2 toxin의 선구체가 된다는 것을 알 수 있었다(6).
긱종 질소뭔이 T-2 toxin 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, (NH4)2$O NH4C1, NH4NO3, KN0를 사용한 배지에서 배지 100 ml 당 약 150 g의 T-2 toxin 이 생성되었다(Table 5). NaNO?를 사용한 배지에서는 자라지 못하였다.
네 종류의 Fusarium 균주들을 흰 옥수수 가루 배지로 15에서 14일간 배양한 결과, F. iricinctum NRRL 3299가 가장 독소 생산이 많았다(Tabic 1). 이후의 모든 실험을 이 균주를 사용하여 행하였다
고체배지의 경우, 균주는 높은 온도에서 잘 자라지만. 독소 생성은 낮은 온도에서 많았고, 배양기간이 증가할수록 독소 생성도 증가하였다(Fig. 2). E tricinctum NRRL 3299 균주는 15℃에서 28일 간 배양 시, 100 g의 흰 옥수수 가루 배지 당 약 1500mg의 T-2 toxin을 생산하였다.
샘플의 독소의 양은 표준판의 독소 밴드의 크기와 검기를 비교하여 결정하였다. 실험은 최소 3번 반복하였다.
온도에 따른 독소 생산의 실험으로부터, T-2 toxin 생성이 온 도에 의존한 과정이라는 것을 알 수 있었는 데, 독소 생성은 낮은 온도에서 오래 저장할 수록 생산량이 증가하였다, 배양 온도 전환 실험에서, 낮은 온도에서 생성된 T-2 tox이 높은 온도에서 배양 시 파괴된다는 것을 볼 수 있었는바, 이는 온도에 의존된 T-2 toxin 분해 효소가 작동하여, 생성되었던 T-2 toxin을 분해하여 성장에 시용한다는 것으로 볼 수 있다. 이상의 결과로 뽈 때 T-2 toxin 대사 경로는 온도에 의한 효소 억제 또는 효소 유도 시스템에 의해 조절되는 것이라고 생각할 수 있다.
온도에 따른 독소 생산의 실험으로부터, T-2 toxin 생성이 온 도에 의존한 과정이라는 것을 알 수 있었는 데, 독소 생성은 낮은 온도에서 오래 저장할 수록 생산량이 증가하였다, 배양 온도 전환 실험에서, 낮은 온도에서 생성된 T-2 tox이 높은 온도에서 배양 시 파괴된다는 것을 볼 수 있었는바, 이는 온도에 의존된 T-2 toxin 분해 효소가 작동하여, 생성되었던 T-2 toxin을 분해하여 성장에 시용한다는 것으로 볼 수 있다. 이상의 결과로 뽈 때 T-2 toxin 대사 경로는 온도에 의한 효소 억제 또는 효소 유도 시스템에 의해 조절되는 것이라고 생각할 수 있다. 이 효소 시스템의 지속적인 연구가 T-2 toxin 생성의 더 많은 비밀을 밝혀 주리라고 믿는다.
최적의 고체배지 신정욜 위해 여러 종류의 고채배지를 시험하였다 F tricinclum NRRL 3299을 15℃에서 14일간 배잉한 결과 흰 옥수수 가루 배지에서 독소 생성 가장 많았다(Table 2). 이후의 고체배지 실험은 횐 옥수수 가루 배지로 행하였다.
NaNO?를 사용한 배지에서는 자라지 못하였다. 최종 pH는 KNO요 NH4NO3의 경우 증가하였고, (4)4와 NH0의경우 감소하였다.
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