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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 항산화물질에 대한 연구의 일환으로 현재 식품이나 의약품으로 사용하기 위해 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사로부터 단백질을 추출하여 이를 흔소로 가수분해시킨 후 3단제 막반응기를 사용하여 분자량빌로 분획한 가수분해물들의 배양 간세포 내에서의 항산화 작용 및 항산화효소활성에 대하 검토하였다.
- 세포매양계에서의 계란 노른자 단백질의 5 K 가수분해 몰이 항산화 효소활성에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 catalase, SOD, glutatliione peroxidase 및 glutathione-S- transferase (GST)의 활성을 검토하혔다. 6를 HQ로 분해하여 무독화시키는 catalase의 경우, f-BHP로 유도된 실험군을 를 첨가하지 않은 대조군과 비교하였을 때는 유의성있는 변화가 관찰되지 않았지만, 5 K 가수분해물과 4BHml를 함께 첨가한 실험군을 대조군과 비교하였을 때는대조군보다 1.
제안 방법
- f-BHP의 세포괴사에 대한 가수분해울의 농도별 효과의 세포괴사에 대한 계란 노른자 단백질 가수분해물의 농도별 효과를 관찰하기 위하여, 96-well plate에 간세를 5X104 cells/welK] 되도록 넣고 2시간 COa 배양기에서 배양시킨 다음, 가수분해물믜 농도를 w당 0.5 hi에서 7.5 mg까지 첨가한 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 으로 전체부피를 200 로 조절하고 37t, 5% CC의 조건에서 I&시간 배양시킨 다음 세척하고 SFM과 225 의 전체부피가 200 가 되게 첨가하였다. 이를 다시 2시간 배양시킨 후, MTT assay루 측정하있다.
- t-B의 농도에 따른 정상 간세포의 생존력을 f-BHP 2 시간 처리 후 측정한 결과, 225 의 f-BHP 처리군에서 50% 정도의 세포생존을 보였오므로 225 nM f-BH를 IC 으로 정하였다 (Fig. 2). 또한, t-BHP 놈도벌 세포괴사에 대한 계란 노른자 단백질 가수분해물들의 항산화작욤을 측정한 결과, 의 f-BHF농도에서 가분해물 첨가군이 비첨가군데 비해 5~ 정도 세포 생존율이 증가하였으며, 특히 5 K 가수분해물의 세포 생존율이 가장 높게 나타났다.
- 계란 노른자 단백질 가수분헤물의 농도에 따른 항산화 효과를 관찰하기 위하여 세포괴사를 유발하는 ABHP를 첨가하였을 때 세포 생존율이 가장 높은 5 K 가수분해물을 사용하여 배양 간세포에 전처리한 다음, BHP로 세포의 산화작용을 유발시켜 세포의 생존율을 측정하였다 (Fig- 3). 가수분해물을 농도별로 0.
- 계란 노른자 단백질을 Alcalase로 가수분해시켜 한외여과 막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 KDa, 5 KDa 및 1 KDa인 막을 차례로 통과시켜 얻은 가수분헤물들 (10 K, 5 K 및 1 K 가수분해물)을 배양 정상 간세포 (Chang) 메서의 세포독성을 즉정하여 Fig. 1에 나타내었다. 가수분해물을 첨가하지 않은 군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 가수부 해물을 첨가한 첨가군에서는 모두 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 특히 분자량 한계범위가 5 KDa인 막은 통과하고 1 KDa인 막은 통과하지 않은 가수분해물 (5 K 가수분해물) 의 경우 5 mg을 첨가하였을 때 세포 생존율이 130% 이상으로 가장 높게 나타났다.
- 계란 노른자로부터 레시틴을 추춤하고 남은 잔사를 효율적으로 이욤하기 위하여 효소로 가수분해시킨 후 한외여과막을 사용하여 분자량별로 분획하여, 이들 가수분해물들에 대한 배양세포내에서의 항산화작욤 및 항산화효소 활성에 미치는 영향을 검토하였다.계란 노른자 단백질을 Alcalase로 가수분해시켜 한외여과 막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 KDa, 5 KDa 및 1 KDa인 막을 차레로 통과시켜 얻은 가수분해물 10 5 K 및 1 K 가수분해물들은 배양간세포에 대하여 독성이 전혀 잆는 것으로 나타났다, 또한, f-BHP의 농도에 따른 배양간세포의 생존력을 f-BHP 처리 2시간 후에 측정한 결과, 225 μM에서 50% 정도의 세포생존율을 보였으며, 이 ABHP의 농도에서 각 가수분해물들의 첨가군은 비첨가군에 비해 5-21% 정도 세포 생존율이 증가하였고, 특히 5 K 가수분해물을 첨가하였을 때 가장 높은 세포생존율을보였다.
- 25% trypsin/EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)로 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 다음 세포배양액으로 중화시켜서 원심분리 (80Xg, 3 min) 하였다. 남은 세푸의 pellet에 배양액을 가한 다음, 멸균 피펫으로 반복흡입하여 단일 세포부유액을 만든 후 trypan blue 를 세포투유액과 9:1위 비율로 흔합하여 광학현미경 상에서 혈구 게 산판 (Hemocytometerj을 이용하여 측정하였다.
- 효괴.를 관찰하기 위하여, 먼저 96-well plate 에 간세포를 5X104 cellsveil 이 되도록 넣고 2시간 CO2 배양기에서 배양시킨 다음, 가수분해물의 농도를 well당 5 씩 첨가한 후, 10% FBS가 포함된 DMEM으로 전치] 부피를 200 로 조절하여 37 5% CQ의 조건에서 18시간 배양한 후, FBS로 세척하고 serum free medium (SFM) 과 f-BHP를 0 uM에서부터 300 nM까지 농도별로 전체 부피가 200 가 되게 첨가하였다. 이를 다시 2시간 배양시킨 후, MTT assay로 측정하였다.
- 를 관찰하기 위하여, 먼저 96-well plate 에 간세포를 5X104 cellsveil 이 되도록 넣고 2시간 CO2 배양기에서 배양시킨 다음, 가수분해물의 농도를 well당 5 씩 첨가한 후, 10% FBS가 포함된 DMEM으로 전치] 부피를 200 로 조절하여 37 5% CQ의 조건에서 18시간 배양한 후, FBS로 세척하고 serum free medium (SFM) 과 f-BHP를 0 uM에서부터 300 nM까지 농도별로 전체 부피가 200 가 되게 첨가하였다. 이를 다시 2시간 배양시킨 후, MTT assay로 측정하였다.
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세포독성 측정
정상 간세포 (Chang)에 대한 계란 노른자 단백짙 가수분해물의 세포독성을 관찰하기 위하여, 먼저 96~well plate 에 간세포를 5X104 cells/well이 되도록 넣고 2시간 CO2 배양기에서 배양시킨 후, 가수분해물을 0-7.5 이 되도록 각각의 well에 첨가한 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM으로 전체부피를 200 로 조절하여 37℃, 5% CO2 의 조건에서 18시간 배양한 후, MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다 (이때 100% 세포괴사는 0, 9% 2-mer- captoethanol을 넣어 2시간 배양시킨 후, MTT assay로 세포의 생존율을 측정한 값으로 하였다).
- 정상 간세포 (hepatocytes, Chang)를 fetal bovine serum (FBS)이 10% 함유된 dulbecco's modified eagle medium (DMEM)으로 배 양하였다. 즉, 75~cm2 plastic flask (Falcon Co.
- 따라 분획하였다. 즉, Alcalase로 가수분해시킨 후 한외여과 막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 KD% 5 KDa 및 1 KDa인 막에 차례로 통과시켜 분획한 후 동결건조하여 가수분해물을 제조하였다
- 측정하였다. 즉, bicincltomimic acid protein kit를 이용하여 bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 표준검량선으로부터 그 양을 산출하였다.
대상 데이터
- 가수분해시 시용한 효소인 Alcalase는 Novo. Co. (Den- mark)으로부터 구입하였으며, 계란 노른자 단백질을 가수분해 시켜 분자량별로 분획하기 위해 사용한 한외여과막장치(ultrafiltration membrane system)는 Millipore Co. (Bedford, MA, USA)으로부터 구입하였고, 사용된 막의 분자량한졔범위 (molecular weight cut-off : MVCO)는 각각 10 KDa, 5 KDa 및 1 KDa을 사욤하였다.
- 본 실험에 사용한 계란 노른자는 레시틴을 추출하고 남은 잔사로 곙기도 용인에 위치한 두산인재기술게발원에서 구입하여, 잔존하는 지질을 제거하고 남은 단백질을 2-mer- captoethan이로 환원시켜 시용하였다.
- 세포 배양계에서의 항산화작용과 항산화 효소활성을 측정하기 위해 사용한 정상 간세포 (Ch)는 Japan Health Sciences Foundation QHSF, Tokyo, Japan)으로부터 분주받아 사용하였으며, 그외의 butyl hydroperoxide (f- BHP)Z MTT (4, 5-dimethyI thiazol-2-yl)-2, 5iphenyl tetrazoli- um bromide), dulbecco's modified eagle medium (DMEM), L-glutamine, hydrogen peroxide (H2O2), dimethyl sulfoxide (DMSOJz 만hylenediamine tetraacetic acid (EDTA), superoxide dismutase (SOD : from bovine liver), xanthine, xanthine oxidase (XOD), nitro blue tetrazolium (NBT), catalase (from bovine liver), diethylene triamine pentaacetic acid (DETAPAC), reduced glutathione (GSH), oxidized glutafhione-reducfase (GSSG-reductase), p -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)는 Sigma Cliemical Co. (St. Louis, MO, USA), fetal bovine serum (FBS) 및 arLtibiotic/antimycotics는 Gibco Co. (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), malondialdehyde tetra butylammonium salt는 Fluka Co. (Fluka Chimie AG, Switzerland), l-chloro-2, 4-dii-iitrobenzene (CDNB) 과 NaNs는 Aid- rich Chemical Co. (Milwaukee; USA)으로부터 구입하몄으며, 그 외의 모든 시약은 분석묨 특급시약을 사욤하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 실험군간의 결과에 대하여 students t-test를 실시하여 유의성 여부를 검증하였고, p값이 0.05 이하인 경우에 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 가수분해물은 Park 등[22]의 방법에 따라 계란노른자 단백 질을 Alcalde로 가수분해시켜 각 단계별로 분자량 크기에 따라 분획하였다. 즉, Alcalase로 가수분해시킨 후 한외여과 막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 KD% 5 KDa 및 1 KDa인 막에 차례로 통과시켜 분획한 후 동결건조하여 가수분해물을 제조하였다
- 배양세포 내 catalase 활성도는 Aebi 방법에 준하여측정하였다. 즉, 먼저 50 mM phosphate buffer (KH2PO4- Na2HPO4 - 12H2O; pH 7.
- 배양세포 내 glulathione-S-transferase 활성도는 Habig 등 [6]과 Schbder 등[25]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 0.
- 배양세포 내 glutathione peroxidase 활성도는 Paglia 및 Valentine[21]과 Lawrence 및 Burk[ll]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 50 mM potassium phosphate buffer (KH2PO4- K2HPO4, pH Z0)로 희석시킨 세포부유액 0.
- 배양세포 내 superoxide dismutase 활성도는 Oyanagui [2미와 Oberiey 등[17]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 50 mM phosphate buffer (KHzPQrN&zHPQ , 12HjO, pH 7-8)로 희석시킨 세포부유액 0, 1 I에 반응혼합액 [1.
- 배양세포의 단백질 정량은 Smith 등[28]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, bicincltomimic acid protein kit를 이용하여 bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 표준검량선으로부터 그 양을 산출하였다.
성능/효과
- Superoxide anion을 제거하는 SOD 활성의 경우, ^-BHP 로 유도된 실험군에서는 t-BHP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 활성이 약간 증가하였고, 5 K 가수분해물과 를함께 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 약간 감소하였지 만 유의성있는 변화는 관찰되지 않았다 (P<0.05, Fig. 5). 또한, Lipid peroxide 및 HQ?의 분해를 촉매하는 GSH peroxidase의 경우, f-BHP로 유도된 실험군은 대조곤보다 L4배, 5 K 가수분해물과 함께 사욤한 실험군은 대조군보다 L8배 증가하여 대조군보다 활성이 유의성있게 증가하였다 (P<0.
- 3). 가수분해물을 농도별로 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 및 7.5 mg/nie 첨가하여 즉정한 결과 L0 ing/mfi 일 때 80% 정도로 가장 높은 세포 생존율을 나타내었다. Pascoe 및 Reed[23]는 항암제로 glutathione (GSH)를 소비하여 반옹산소종을 생성하는 adriamycin (ADR)의 사용에 의해 발생되는 심근경색은 ADR이 산화-환원되는 동안 활성 산소계의 생성과 GSH의소비와 관련이 있다고 판단하여 이에 대한 -tocopherol 의 효과를 측정한 결과, 세포 내 -tocophrol의 농도가 0.
- 1에 나타내었다. 가수분해물을 첨가하지 않은 군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 가수부 해물을 첨가한 첨가군에서는 모두 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 특히 분자량 한계범위가 5 KDa인 막은 통과하고 1 KDa인 막은 통과하지 않은 가수분해물 (5 K 가수분해물) 의 경우 5 mg을 첨가하였을 때 세포 생존율이 130% 이상으로 가장 높게 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용한 가수분해물들믄 배양 정상 간세포에 독성믈 나타내지 않을 뿐만 아니라 오히려 세포 증식효과가 있는 것으로 나타났다.
- 미치는 영향을 검토하였다.계란 노른자 단백질을 Alcalase로 가수분해시켜 한외여과 막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 10 KDa, 5 KDa 및 1 KDa인 막을 차레로 통과시켜 얻은 가수분해물 10 5 K 및 1 K 가수분해물들은 배양간세포에 대하여 독성이 전혀 잆는 것으로 나타났다, 또한, f-BHP의 농도에 따른 배양간세포의 생존력을 f-BHP 처리 2시간 후에 측정한 결과, 225 μM에서 50% 정도의 세포생존율을 보였으며, 이 ABHP의 농도에서 각 가수분해물들의 첨가군은 비첨가군에 비해 5-21% 정도 세포 생존율이 증가하였고, 특히 5 K 가수분해물을 첨가하였을 때 가장 높은 세포생존율을보였다. 또한, 가수분해물 첨가 농도에 따른 항산화작용은 5 K 가수분해물을 L0 mg/를 첨가하였을 때 80% 정도로가장 높은 세포 생존율을 나타내었다, 한편, f-BH로 세포괴사를 유발시킨 실험군에 가수분해물을 첨가하였을 때 catalase, GSH peroxide, GST의 활성을 증가하였으나, SOD 의 활성은 약간 감소하였다.
- 가수분해물을 첨가하지 않은 군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 가수부 해물을 첨가한 첨가군에서는 모두 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었고, 특히 분자량 한계범위가 5 KDa인 막은 통과하고 1 KDa인 막은 통과하지 않은 가수분해물 (5 K 가수분해물) 의 경우 5 mg을 첨가하였을 때 세포 생존율이 130% 이상으로 가장 높게 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용한 가수분해물들믄 배양 정상 간세포에 독성믈 나타내지 않을 뿐만 아니라 오히려 세포 증식효과가 있는 것으로 나타났다.
- 2). 또한, t-BHP 놈도벌 세포괴사에 대한 계란 노른자 단백질 가수분해물들의 항산화작욤을 측정한 결과, 의 f-BHF농도에서 가분해물 첨가군이 비첨가군데 비해 5~ 정도 세포 생존율이 증가하였으며, 특히 5 K 가수분해물의 세포 생존율이 가장 높게 나타났다.
- 이 결과는 최 등이 배양간세포 (AC2F)에서 녹용의 항 산화효소 활성을 측정한 결과, catalase, GSH peroxidase 및 GST 활성은 t-BHP 처리군보다 녹용과 t-BHP를 함께 처리한 실험군에서 더 높은 활성을 나타내었고, SOD 활성 만 실험군이 대조군에 비해서 약간 낮은 활성을 나타내었다고 보고한 결과와 일치하였다.
- 이상의 결과로 뽈 때 ABH고의 처리로 세포괴사를 유발시칸 후, 5 K 가수분해물을 첨가하였을 때 세포 생존율이 증가히는 것은 catalase, GSH peroxidase 및 GSH reductase등의 항산화효소 활성의 증가에 기인하는 것으로 사료된다.
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