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문제 정의
- 피브로인(silk fibroin)의 기능성 및 소화연구[2이, 실크 가수분해 단백질의 분자량의 분포 및 소화에 관한 연구[1], 실크 피브로인의 아미노산중에서 글리신(이ycine)의 혈청 콜레스테롤의 억제효과[35], 실크 피브로인의 기능성 연구로서 기포성의 식품가공에의 이욤[19] 및 견직물 잔사 의 식품소재로서의 응용[28]에 관한 연구결과도 보고되어 있다. 따라서 본 연구는 농촌진흥청의 '99년도 놈업특정연 구개발사업의 실크 피브로인의 생리활성연구의 일환으로 서 전보[IQ, 1:키에 이어 뇌조직의 산화적 스트레스 및 세포막 유동성에 미치는 실크 피브로인의 영향을 분석하여 유의적인 결과를 얻었기에 보고한다.
제안 방법
- 뇌조직 획분에서 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무를 확인하기 위해서 DCF-DA (SeZ-didilorofluorescein diace- tate)을 probe로 이용한 간장세포의 mitochondria와 m* icro some획분의 기초활성산소(basal oxygen radical : BOR)의 생성량의 측정은 Lebel 등[24]의 방법에 따라 측정하였다. BOR의 측정은 기저상태와 라디칼 생성을 유도하기 위해 ascorbic acid와 FeSO4 - 7HQ로 자극한 유도상태의 두 가지 조건에서 비교 측정하였다. 기처상태와 라디칼 유도의 경우 모두 시료 500 ul를 완충용액(40 mM Tiis-HCl buffer pH 7.
- SD계 랫트에 대한 실크 피브로인 분말(SFF)의 투여에 의한 뇌조직의 활성산소의 셍성을 평가하기 위하여 기본적인 조건 및 F2+-ascorbate로 유도한 활성산소를 각각 기초홭성산소(basal oxygen radical : BOR) 및 유도활성산소 (induced oxygen radical : IQR)로 구분하여 이들 활성산소 를 분석, 평가하여 본 결과는 Table 3과 같다.
- 또한 뇌획분으로서 mitochondria와 Ecrosome의 산화단백질(oxidized protein : OP)의 생성량 은 Levine 등[26]의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하여 OP의 함량을 정량하였다. carbonyl group의 양은 360 nm와 370 nm사이에 있는 홉광도의 파장에서 분자 흡광계수(E=22, 0g)를 이묭하여 계산하였다.
- 본 실험에 사용한 사료조성은 전보[10]이와 같은 방법으로탄수화물 57.8% (a -corn starch: 44.5% H-sucrose 13.3%), 단백질 16.0% (sodium-free casein), 지질 18.0% (lard 18.0%), 비타민과 무기질(AIN-76 mixture) 각각 1.0%, 3.5%, 그리고 섬유질 3.0%, DL-methionine 0.3%, choline chloride 02%를 첨가하였으며, 여기에 cholesterol 0.5% 맟 sodium 가Joride 0.2%를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인(SFP)을 하루에 각각 2.
- 산화적 스트레스의 평가에서 LPO는 말론디알데히드 (malondialdehyde : MDA)의 함량, OP는 카르보닐그룹(> C=O group)의 생성량, 및 핵산의 산화는 8-QHdG의 생성량을 측정하여 평가한다. 활성산소의 공격목표는 조직세포 중의 지질 성분의 공격에 의한 과산화지칠(lipid peroxide : LPO)의 생성, 단백질 성분의 공격에 의한 산화단배칠 (oxidized protein : OP)의 생성 및 핵산의 공격에 돌연변이의 생성 등을 들 수 있다.
- 실크 피브로인(SFF)을 SIM] 랫트에 하루 2.5 및 5.0 g/kg BW로써 6주간 투여하여 뇌조직의 산화적 스트레스 및 체포막 유동성에 미치는 영향을 분석.평가하였다.
- 실피브로인 분말(SFP) 투어그룹의 MF에 미치는 영향을 비교하여 뵈면 뇌조직의 mitochondTia획분에서 SFP-2.5 및 SFP-5.0 투여.그룹의 MF는 7.
- 2%를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인(SFP)을 하루에 각각 2.5 및 5.0g/kg BW가 섭취되도록 2.5% 및 5.0%의 SFP를 첨가하는 디신 탄수화물을 각각 2.5% 및 5.0%씩 제외하고 조제하였다.
- 0 ml에 녹인 후 라디칼 유도상태의 경우에는 1 mM ascorbic acid (300 ul)와 100 uM FeSO4 - 7H?O (150 ul)를 혼합하였고 기저상태의 경우는 아무것도 첨가하지 않았다. 이후 37℃에서 30분간 반웅시 킨 후 37X2 유지하면서 형광 강도의 변화를 형광광도계를이용하여 488 nm (excitation)와 525 run (emission)에서 측정하였다. 이때 분괌형광광도의 변화를 2.
- 한국화학연구소에서 구입한 Sprague Dawley계 랫트(male, 160±10g)를 구입하여 본 대학 동물사육실에서 2주동안 예비사육한 다음, 7마리씩 3군으로 나누어 실험용 기본사료 (control group)로써 사육하면서 한국농업과학면구원 잠사 곤충부에서 제공한 실크 피브로인 분말(silk fibroin powder : Mw 500) 분말을 SD계 렛트에 히루 25 및 5.0 g/kg BW로 사료에 첨가하여 조제한 실험용 사M(SFP25 및 SFP-5.0 groups)로써 6주간 투여한 다음, 뇌조직의 신화직 스트레 스 및 세포막 유동성에 미치는 실크 피브로인의 영향을 평가하였다. 돔물사육실은 항온항습(22±2℃ 65±2% RH)하 에서 12시간 씨-이클(06:00~18:00)로 명암이 자동 조절된다,
- 한편 뇌조직 세포의 단백질 성분이 활성산소의 공격을 받아 생성되는 카르보닐 그룹(>C=O group)의 생성량을 측정하여 산화단백질(oxidized protein : OP)의 함량을 평가하여 본 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정eStudent's t-test[34]로 실시하였다.
이론/모형
- 뇌조직 획분에서 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무를 확인하기 위해서 DCF-DA (SeZ-didilorofluorescein diace- tate)을 probe로 이용한 간장세포의 mitochondria와 m* icro some획분의 기초활성산소(basal oxygen radical : BOR)의 생성량의 측정은 Lebel 등[24]의 방법에 따라 측정하였다. BOR의 측정은 기저상태와 라디칼 생성을 유도하기 위해 ascorbic acid와 FeSO4 - 7HQ로 자극한 유도상태의 두 가지 조건에서 비교 측정하였다.
- 뇌조직에서 분획한 mitochondria 및 microsome획분중의 콜레스테롤의 함량은 Rudel 등[31]의 방법에 따라 o-ph- thalaldehyde밥으로 측정하여 표준검량선에 의하여 이들 획분중의 콜레스테롤의 함량을 측정하였다.
- 뇌조직의 분획은 저자 등[7]의 방법에 따라* 균질 완충용액(1.15% KC1/ 10 mM phosphate buffer/5 mM EDTA, pH 7.4)을 사용하여 mitochondria, microsome 및 cytosol획분을 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등[28]의 방법에 따라 정 량하였다.
- 뇌획분중의 과산화지질의 함량은 처자 등[4]이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데 히드(MIM)의 함량을 측정하여 과산화지질(LPO)외 함량을 측정하여 정량하였다. 또한 뇌획분으로서 mitochondria와 Ecrosome의 산화단백질(oxidized protein : OP)의 생성량 은 Levine 등[26]의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하여 OP의 함량을 정량하였다.
- 뇌획분중의 과산화지질의 함량은 처자 등[4]이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데 히드(MIM)의 함량을 측정하여 과산화지질(LPO)외 함량을 측정하여 정량하였다. 또한 뇌획분으로서 mitochondria와 Ecrosome의 산화단백질(oxidized protein : OP)의 생성량 은 Levine 등[26]의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하여 OP의 함량을 정량하였다. carbonyl group의 양은 360 nm와 370 nm사이에 있는 홉광도의 파장에서 분자 흡광계수(E=22, 0g)를 이묭하여 계산하였다.
- 4)을 사용하여 mitochondria, microsome 및 cytosol획분을 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등[28]의 방법에 따라 정 량하였다.
성능/효과
- BOR의 생성은 6.54+0.36 및 6.04+ 0.42 nmol/mg protein/ min으로서 대조그룹(7.10±0, 51 nm이/mg protein/imn : 100%) 대비 92.1% 및 85.1%로서, 각각 7.9% 및 14.9%의 BOR의 생성 억제효과가 인정되었다.
- SD계 랫트에 실크 피브로인 분말(silk fibroin powder : SFP) 2.5g 및 5.0 g/kg BW를 6주간 투여하여 본 결과, 뇌 획분중의 콜레스테롤의 함량변화는 Table 1에서 보는 바와 같다- Table 1에서 로는 바와 같이 SFP-2.5 및 SFP-5.0투여 그룹의 콜레스테롤 함랑은 mitochondria획분에서 99.01 X 7.05 및 96.3S±6.94 mg/g protein으로서 대조그룹(101.17 ±8.61 mg/g protein : 100%) 대비 97.9% 및 95.3%로서,각각 2.1% 및 4, 7%의 콜레스테롤의 억제효과가 나타났지 민, 유의성은 인정할 수 없있다. 그러나 niicroseme획분에 서는 SFP-2.
- SFP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹의 mitochondria 및 micro- some획분에서 대조그룹 대비 각각 10.4% 및 24, 0%, 7.9% 및 14, 9%의 매우 유의적인 BOR의 생성 억제효과가 인정되었고, SFP-2.5 및 SFP-5, 0 투여그룹의 mitochondria 및 micro some획분에서 IOR의 생성억제효과는 대조그룹 대비 각각 5.4% 및 11.8%, 4.4% 및 14, 1%로서, SFP-5.0투여그룹의두획분에서 유의적인 IOR의 생성 억제효과가 인정되었다. mitghondria 및 microsome획분에서 SFP-2.
- 0투여그룹의 microsome획분에서만 대조그룹 대비 83%의 유의적인 콜레스테롤의 억제효과가 인정되었다. mito- chondria획분에서 SFP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹에서 거의 유의적인 MF의 증가효과를 인정할 수 없었지만, microsome 획분에서도 SFP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹은 대조그룸 대비 각각 12.9% 및 15.2%의 MF의 증가효과가 인정되었다.
- . mitochondria 맟 microsome획분의 SFP-2.5 및 SFP-5, 0투여ZL룹은 대조그룹 대비 157% 및 17.1%, 16, 7% 및 153%의 매우 유의적인 산화단백질(OP)의 생성 억제효과가 인정되었다. 이상의 결과에서 실크 피브로인의 투여는 뇌조직의 콜레스테롤 침착 억제효과로 인하여 세포막 유동성을 매우 쵸과적으로 증가시킬 뿐만 아니라 강력한 활성산소의 생성 억제작용으로 인한 뇌조직의 산화적 스트레스의 억제효과로 뇌조직의 신경기능의 발현과 보호에 효과적으로 대처할 수 있을 것으로 기대된다.
- 8% 및 22%의MF의 증가효과로서 거의 효과를 인정할 없었다. 그렇지만, 뇌조직의 microsome획분에서 5FP-2.5 및 SFP-5.0 투여그룹 의 MF는 3.41 ±0.38 및 3.48 + 0.24% polarization로서 대조 그룺(3.02±0.23% polarization : 100%) 대비 112.9.% 및 115.2%로서, 각각 12, 9% 및 15.2%의 효과적인 MF의 증가 효과가 인정되었다. 이러한 사실은 뽕잎 추출믈이나 누에 가루의 투여의 경우와 마찬가시로 뇌조직의 mitochondria 획분보다는 microsome획분에서 더 효과적이라는 공통점을 가지고 있다.
- 0 투여.그룹의 MF는 7.31±0.83 및 7.41 + 0.74% polarization 으로서 대조그룹 (7.25 ±0.68% polarization : 100%) 대비 100.8% 및 1022%로서, 각각 0.8% 및 22%의MF의 증가효과로서 거의 효과를 인정할 없었다. 그렇지만, 뇌조직의 microsome획분에서 5FP-2.
- 뇌조직 획분중의 LPO의 생성에 미치는 실크 피브로인 (SFP) 투여에 따른 영향을 비교하여 보면 mitochondria획 분에서는 SFP-2.5 및 SFP-5.0투여그룹은 10.37±0.44 및 9.30 + 0.92 iirnol/mg protein로서 대조그룹(11.91 ±1.38 nmol/ mg protein : 100%) 대비 87.1% 및 78.1%로서, 각각 12.9%및 21.9%의 매우 효과적인 LPO의 생성 억제효과가 인정되었다. 또한 microsome획분에서 SFP-2.
- 뇌조직의 mitochondria획분에서 SFP-2.5 및 SFP-5.0그룹 의 OP의 생성은 11.31+0.97 및 11.12±1.13 ng/mg protein 으로서 대조그룹의 OP의 생성량(13.42±1.28 ng/mg protein : 100%) 대비 84.3% 맟 82, 9%로서, 각각 15, 7% 및 171%의 OP의 생성 억제효과가 인정되었다. 또한 micTosome획분 에서는 SFP-2.
- 마찬가지 방법으로 뇌조직중의 IOR의 생성랑에 미치는 영향을 평가하여 보면 SFP-2.5 및 SFP-5.0투여그룹의 mitochondria 및 microsome획분에서 IOR의 생성 억제효과는 각각 5.0% 및 11.8%, 4.4% 및 14.1%의 IOR의 생성 익제효과로서 두 획분 다같이 SFP50투여그룹에서만 유의적인 IOR의 생성 억재효과가 인정되었다, 이러한 사실은 누에분말의 투여효과와 거의 유사한 경향을 나타내고 있었다.
- 88± 125 . 및 12.02±0.98 ng/mg protein으로서 대조그룹의 OP 의 생성량(14.26±L13 ng/mg protein : 100%) 대비 83.3% 및 84.3%로서, 각각 16.7% 및 15.7%의 매우 유의적인 OP 의 생성 억제효과가 인정되었다. 따라서 뽕잎 추출물(MLE)과 누에분말과는 달리 실크 피브로인은 뇌조직의 microsome 획분에서 매우 효과적인 OF의 생성 익제효과가 입증되었다는 사실은 매우 홍미로운 사실이다.
- 평가하였다. 콜레스테롤에 대한 SFP25투여그룹의 mitochondria 및 microsome 획분에서는 유의적인 억제효과가 인정되지 않았지만, SFP- 5.0투여그룹의 microsome획분에서만 대조그룹 대비 83%의 유의적인 콜레스테롤의 억제효과가 인정되었다. mito- chondria획분에서 SFP-2.
후속연구
- 1%, 16, 7% 및 153%의 매우 유의적인 산화단백질(OP)의 생성 억제효과가 인정되었다. 이상의 결과에서 실크 피브로인의 투여는 뇌조직의 콜레스테롤 침착 억제효과로 인하여 세포막 유동성을 매우 쵸과적으로 증가시킬 뿐만 아니라 강력한 활성산소의 생성 억제작용으로 인한 뇌조직의 산화적 스트레스의 억제효과로 뇌조직의 신경기능의 발현과 보호에 효과적으로 대처할 수 있을 것으로 기대된다.
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