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제안 방법
- 농도별 김 치 용매 획 분과 0.1 mg/mL의 LDL 단백질이 함유된 반응액에 LDL 산화를 유도하기 위해 의 최종농도가 2 UM가 되도록 첨가하여 2시간 동안 40"C에서 산화시킨 후 이 반응액 0.5 mL에 0.4% TBA, 15% TCA. 2.
- 이 때지용성 획분은 olive oil에 녹여 식이에 혼합하였다. 사료는 자유식으로, 식수는 제한없이 섭 취 하도록 했으며 모든 사료는 4"C 냉장보관하에 신선하게 공급하고, 실험기간 동안 사육실의 온도는 20"C, 상대습도는 55%를 유지하였으며 명암주기는 12시간 간격으로 조절하였다.
- LDL 단백질 농도가 0.1 mg/mL가 되 게 LDL을 취 하여여기 에 대조군은 알코올(최종 농도 0.5%)을 첨가하고 실험 군은 알코올 또는 phosphate buffered saline에 녹인 김치의 용매획분을 최종농도 25Ug/mL되게 첨가하였다. 실험 시작 직전에 Cif*을 최종농도 2 μ]\4이 되게 첨가하여잘 섞은 다음 LDL 자동산화를 유도하였다.
- 측정된 conjugated diene 농도를 시간에 대해 plotting하면 LDL 산화곡선을얻을 수 있다. LDL 산화가 시작되는 점을 연장한 직선과전파기의 곡선의 정점에서 직선을 그은 점이 만나는 지점 을 구하여 이를 유도기로 하고, 유도기 의 시간을 계산하였다.
- 김 치 용매획분중 in vitro 실험에서 LDL 산화 억 제 효과가 가장 컸던 dichloromethane(CH2C) 획 분, 그리고 이와 유사한 항산화 효과를 보였던 ethylacetate(EtOAc) 획분을 선택하였고, 물획 분은 항산화 효과는 다른 두군에 비해 다소 떨어지나 식품첨가 시에 적용하기에 편리한 점을고려하여 세가지 획분을 선택하여 동물실험을 실시하였다. 식이는 고형 사료(Purina rabbit chow pellet)을 분말로만든 두), 동맥경화를 유발하기 위해 1% 콜레스테롤(w/ w)을 혼합하여 사용하였으며(대조군) 이 식이에 5% 동결건조 김치에 해당되는 CHzCh, EtOAc 획분과 물획분을 Table 2와 같이 첨가하여 8주간 사육하였다(21).
- 김 치의 용매별 분획물의 항동맥경화성을 살펴보기 위하여 LDL의 산화양상을 conjugated diene 생 성 량으로부터 LDL 산화 curve을 얻은 다음 이로부터 산화유도기를계 산하였다. 김 치 용매 획 분을 첨가한 LDL의 산화는 전 형적인 지질산화양상을 나타내었으며 이들 김치용매획분첨가군의 유도기는 대조군에 비해 길었다.
- 김치에 들어있는 유기성분을 극성을 달리한 용매를 이용하여 순차적으로 분획하였다. 동결건조 김치시료를 분말로 만들어 핵 산으로 3회 반복 추출하고 잔사물을 5배 의메 탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다.
- 김치에 들어있는 유기성분을 극성을 달리한 용매를 이용하여 순차적으로 분획하였다. 동결건조 김치시료를 분말로 만들어 핵 산으로 3회 반복 추출하고 잔사물을 5배 의메 탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다. 메 탄 올 추출물을 회 전식 진공농축기를 이용하여 농축한 후, 다시디 클로로메 탄, 에 틸아세 테 이 트, 부탄올로 용매 분획 하여 용매를 제거하고 실험에 사용하였다.
- Kwon(15)과 Kim(16)은 주], 토끼를 이용한 동물실험에서 배추김치가 혈중지질 농도를 저하시키는 효과가 있을 뿐만 아니라 김치 담금 때 첨가하는 부재료인배추, 마늘, 고추 등을 첨가한 식이로 8주간 사육한 토끼의동맥궁에 지질이 침착하는 정도가 현저하게 차이가 있음을보고하여 김치에 동맥경화 예방효과가 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 동맥경화 예방성이 있는 김치의활성물질을 찾기 위한 기초 연구로 잘 숙성된 배추김치를용매 분획 하여 동맥 경 화를 유발하는 원 인중의 하나인 LDL 산화를 억제하는 정도를 in 杭仃0에서 측정하고 여기서 얻어진 결과를 바탕으로 동맥경화식이(1% 콜레스테롤 식이)에 활성이 큰 김 치의 용매획분을 첨가하여 토끼를 8주동안 사육하면서 지질저하 효과 및 LDL 산화정도를 측정함으로써 김치 용매 획 분의 동맥경화 예방성을 in vitro 와 in uiuo에서 검토하였다.
- 함량은 효소법 (24)에 의한 정 량용 kit시약(triglyceride kit BC 118, 영동제약)으로측정 하였다. 또한 분리 된 LDL을 이용하여 TBARS를 측정하였다.
- 사육 0주, 4주, 8주째 분리 한 토끼 의 혈장으로부터 분리 한 LDL을 CuSQ로 산화시 켜 TBARS값을 측정 하였다(Fig. 4). 0주의 TBARS값은 대조군이 28.
- 사육기 간중 체중은 매 주 측정 하였고, 2주 간격 으로 토끼의 후이개 정맥에서 채혈하여, 혈중 콜레스테롤 및 중성 지 방, 지 단백 분획 에서 콜레스테롤 및 중성 지 방농도 변화를 관찰하였다.
- 김 치 용매획분중 in vitro 실험에서 LDL 산화 억 제 효과가 가장 컸던 dichloromethane(CH2C) 획 분, 그리고 이와 유사한 항산화 효과를 보였던 ethylacetate(EtOAc) 획분을 선택하였고, 물획 분은 항산화 효과는 다른 두군에 비해 다소 떨어지나 식품첨가 시에 적용하기에 편리한 점을고려하여 세가지 획분을 선택하여 동물실험을 실시하였다. 식이는 고형 사료(Purina rabbit chow pellet)을 분말로만든 두), 동맥경화를 유발하기 위해 1% 콜레스테롤(w/ w)을 혼합하여 사용하였으며(대조군) 이 식이에 5% 동결건조 김치에 해당되는 CHzCh, EtOAc 획분과 물획분을 Table 2와 같이 첨가하여 8주간 사육하였다(21). 이 때지용성 획분은 olive oil에 녹여 식이에 혼합하였다.
- 정도를 in ui”。에서 측정하여 이들 중 현저하게 항산화 효과를 보인 김치 획분의 지질대사 저하효과를 in vivo 에서 확인하였다. 토끼 에 게 1% 콜레스테롤을 첨가한 식이에 in 庆Ao에서 LDL 산화억제 효과가 컸던 CHaCh 및 EtOAc획분과 물획분을 5% 동결건조 김치에 해당되는양만큼 대조군식이에 첨가하여 8주간 사육하면서 혈장및 지 단백 획분의 콜레스테롤 및 중성지질 변화를 관찰하였 다.
- 주줄하였다. 이 메탄올 주줄물을 극성 이 다른 CH2CI2, EtOAc, 그리고 BuOH 순으로 분획하였으며, 남은 층을물층으로 하였다. 이들 용매 획 분의 수득율은 Table 3에 나타내었다.
- 실험 시작 직전에 Cif*을 최종농도 2 μ]\4이 되게 첨가하여잘 섞은 다음 LDL 자동산화를 유도하였다. 이들 반응액을 cuvette에 기포가 생기지 않게 넣은 다음 실온에 두면 LDL 자동산화가 진행되고 LDL 산화 과정중 생성되는 conjugated diene 농도를 10분 간격으로 자동적으로 측정하게 프로그램 된 diod array spectrophotometer (model 8452A, Hewlett Packard, Rockville, MD, US A) 을 이용하여 234 nm에서 측정하였다(18, 19). 측정된 conjugated diene 농도를 시간에 대해 plotting하면 LDL 산화곡선을얻을 수 있다.
- 확인하였다. 토끼 에 게 1% 콜레스테롤을 첨가한 식이에 in 庆Ao에서 LDL 산화억제 효과가 컸던 CHaCh 및 EtOAc획분과 물획분을 5% 동결건조 김치에 해당되는양만큼 대조군식이에 첨가하여 8주간 사육하면서 혈장및 지 단백 획분의 콜레스테롤 및 중성지질 변화를 관찰하였 다. In vitro 실험 결 고]■, 김 치 용매 획 분을 첨가한 LDL의산화정도를 TBARS 농도로 나타내었을 때 BHT, Hex.
- 통배추를 4등분하여 10% 소금물 용액(수온 10℃)에 11시간 담궈 절인 후 물로 3회 씻어서 2시간 동안 물기를뺀 후 부산대학교 김치연구소에서 개발한 김치 recipe 중의 하나인 부재료의 양이 비교적 적게 첨가된 담금법 (Table 1)으로 포기김치를 담았다. 김치는 재래식 독에담아 상온에서 하루 방치한 후 냉장 온도에서 15일간 숙성시켰다.
대상 데이터
- 5 kg 인 것을 사용하였고, 고춧가루는 경북 안동 일직농협조합에서 가공한 안동청결 고춧가루, 마늘은 남해에서 재배된 것을 사용하였다. 그 이외에 필요한 부재료는 인근 재래시장에서 구입하여 사용하였다.
- 김치용매획분의 동맥경화 예방효과를 in uiuo에서 살펴 보기 위하여 동맥 경화를 쉽게 유발하는 토끼 (New zca land white rabbit)를 대한실험동물센터에서 분양 받아각군당 6마리 씩 총 4군으로 하여 실험을 행하였다(Table 2). 김 치 용매획분중 in vitro 실험에서 LDL 산화 억 제 효과가 가장 컸던 dichloromethane(CH2C) 획 분, 그리고 이와 유사한 항산화 효과를 보였던 ethylacetate(EtOAc) 획분을 선택하였고, 물획 분은 항산화 효과는 다른 두군에 비해 다소 떨어지나 식품첨가 시에 적용하기에 편리한 점을고려하여 세가지 획분을 선택하여 동물실험을 실시하였다.
- 동결건조 김치시료를 분말로 만들어 핵 산으로 3회 반복 추출하고 잔사물을 5배 의메 탄올로 12시간 교반하여 3회 반복 추출하였다. 메 탄 올 추출물을 회 전식 진공농축기를 이용하여 농축한 후, 다시디 클로로메 탄, 에 틸아세 테 이 트, 부탄올로 용매 분획 하여 용매를 제거하고 실험에 사용하였다.
- 배 추는 김 해 산지 서 출하된 포기 당 중량이 2.0 ~ 2.5 kg 인 것을 사용하였고, 고춧가루는 경북 안동 일직농협조합에서 가공한 안동청결 고춧가루, 마늘은 남해에서 재배된 것을 사용하였다. 그 이외에 필요한 부재료는 인근 재래시장에서 구입하여 사용하였다.
- 김치는 재래식 독에담아 상온에서 하루 방치한 후 냉장 온도에서 15일간 숙성시켰다. 숙성된 포기김치를 적당한 크기로 잘라 동결시킨 후 동결건조하여(해농, 경북포항) 실험용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 'See Table 2 for the composition of experimental diet. 11 eDatas were significantly different analyzed by oneway ANOVA followed Duncan's multiple range test at the 0.05 level of significance.
- 'cDatas in columns were significantly different analyzed by one-way ANOVA followed Duncan's multiple range test at the 0.05 level of significance.
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- 1!See Table 2 for the composition of experimental diet. a~cDatas were significantly different analyzed by one way ANOVA followed Duncan's multiple range test at the 0.05 level of significance.
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- one-way ANOVA followed Duncan's multiple range test at the 0.05 level of significance.
이론/모형
- 사용하였다. 혈장으로부터 지 단백 획 분의 분리는 fixed angle rotor를 사용하여 초원심분리 에 의한 sequential flotation method(22)로 혈장으로부터 밀도가 다른 VLDL, LDL 그리고 HDL의 세 획 분을 얻었匸" 혈 장 HDL, LDL 의 총콜레스테롤 함량은 효소법 (23)에 의한 정 량용 kit 시약(cholesterol E kit BC 108-E, 영 동제 약)으로 측정 하였으며 , 혈장, VLDL의 중성 지 방.함량은 효소법 (24)에 의한 정 량용 kit시약(triglyceride kit BC 118, 영동제약)으로측정 하였다.
- 45 pm syringe-mountable filter을 통과시켜 살균하였다. LDL 의 단백질 농도는 Lowry 법으로 측정 하였으며 한번 분리한 LDLe 3일 이상 사용하지 않았다.
- 혈장으로부터 지 단백 획 분의 분리는 fixed angle rotor를 사용하여 초원심분리 에 의한 sequential flotation method(22)로 혈장으로부터 밀도가 다른 VLDL, LDL 그리고 HDL의 세 획 분을 얻었匸" 혈 장 HDL, LDL 의 총콜레스테롤 함량은 효소법 (23)에 의한 정 량용 kit 시약(cholesterol E kit BC 108-E, 영 동제 약)으로 측정 하였으며 , 혈장, VLDL의 중성 지 방.함량은 효소법 (24)에 의한 정 량용 kit시약(triglyceride kit BC 118, 영동제약)으로측정 하였다. 또한 분리 된 LDL을 이용하여 TBARS를 측정하였다.
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