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문제 정의
- 또한 플라스크 배양에서 L-histidine과 L-tryptophan을 각각 6 g/L의 농도로 첨가한 경우 lovastatin 생산량이 상당히 증가한 결과를 토대로, 상기 두 아미노산의 첨가 시기가 lovastatin 생산에 미치는 영향을 실험하였다. 마지막으로 확립된 최적배양조건에서 회분식 생물반응기를 이용하여 발효한 결과를 발표하고자한다.
- 본 연구에서는 A. wre“s의 펠맅 형태를 유도하여 산소 제한을 해결하기 위한 방법으로 다양한 배양 조건을 실험하였고, 균체생장과 lovastatin 생산성에 미치는 영향 등의 배양 특성을 조사하였다. 그리고 호기성 미생물의 발효에서 고려해야 하는 발효조 운전조건중에서 A.
제안 방법
- Lovastatin 생산에 대한 몇가지 아미노산의 영향을 조사한 선행 연구결과(25)로부터, L-trypiophan과 L-histidine이 높은 lovastatin 생산량을 나타내었다, 본 실험에서는 glucose 50 g/L, glycerol 50 mL/L, peptonized milk 30 g/L, K2HPO4 6 g/L, yeast extract 2.5 g/L, PEG 2, 000 2.5 g/L로 이루어진 최적 배지에 아미노산의 첨가시기를 달리하여 250 n)L 삼각 플라스크에서 27°C, 200 rpm으로 12일 동안 배양하여 lovastatin 생산을 비교해보았다. Figure 3과 4에서 보듯이 L-tryplophan과 L-histidine 둘다 발효를 시작할 때부터 첨가한 것이 아미노산을 첨가하지 않은 것에 비하여 약 L5배 이상의 lovastatin 생산량을 나타내었다.
- Lovastatin 생산에 적합한 pH 조건을 알고자 교반속도 400 rpm 에서 이미 앞서 실험한 pH 7.4가 아닌 일반적인 곰팡이의 배양 pH인 5.8에서 시작하여 발효시 pH를 조절하지 않은 경우와 pH를 5.8로 계속 유지한 경우에 대하여 회분식 배양을 수행하여 결과를 비교해보았다.
- Lovastatin(lactone form)과 mevinolinic acid (acid form)를 각각 농도 30 〜 150 mg/L의 범위에서 분석을 실시하여 검량곡선을 얻었으며, 각 농도에 따라 두 물질을 1 : 1로 혼합하여 30 ~ 150 mg/L의 범위에서 분석을 실시하여 두 물질이 공존하는 경우에 대한 검량곡선을 얻었다. 액체 배양한 균체의 생산물을 정량하기 위해배양액을 분쇄한 후 일정량을 취하고 동량의 medianol을 가한 뒤 30°C 에서 200 rpm으로 1시간동안 진탕하였다.
- 고지혈증 치료제인 lovastatin을 Aspergillus ferreits로부터생산하기 위해 발효조 배양실험에서 교반속도와 pH에 대한영향을 조사하였다. 최적 교반속도는 400 rpm이었고 pH는 5.
- 균체농도를 측정하기 위하여 균질혼합기에서 균질화 과정을 거친 배양액 시료를 15, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 버린 후 증류수를 넣어 와류 혼합을 하고 다시 원심분리하는 세척과정 (3번 반복)을 거친 후 105笆에서 항량을 구하여 건조균체량 (Dry Cell Weight, DCW)을 측정하였다. Lovastatin의 분석은 Roman Kysilka와 Vladiir Kfen등의 방법(17)을 참고하여 HPLC로 분석하였으며, 분석조건은 Table 1과 같다.
- wre“s의 펠맅 형태를 유도하여 산소 제한을 해결하기 위한 방법으로 다양한 배양 조건을 실험하였고, 균체생장과 lovastatin 생산성에 미치는 영향 등의 배양 특성을 조사하였다. 그리고 호기성 미생물의 발효에서 고려해야 하는 발효조 운전조건중에서 A. terras의 배양시 용존산소와 미생물의 형태에 영향을 미치는 임펠러의 교반속도 및 pH를 조절하여 최대의 lovastatin 생산량을 나타내는 발효 조건을 확립 하였다. 또한 플라스크 배양에서 L-histidine과 L-tryptophan을 각각 6 g/L의 농도로 첨가한 경우 lovastatin 생산량이 상당히 증가한 결과를 토대로, 상기 두 아미노산의 첨가 시기가 lovastatin 생산에 미치는 영향을 실험하였다.
- wrens의 경우도 배양조건에 따라 두 가지 성장형태를 보이는 것으로 관찰되었으며 성장 배지에서 큰 펠맅으로 성장할 경우 그 종배양액을 생산 배지로 접종할 때 균일한 양의 균체를 접종하기가 어려웠다. 따라서 커다란 펠맅으로 균체가 성장한 경우는 펠맅을 미분쇄기로 분쇄하여 생산배지에 접종하는 방법에 의해 접종 조건이 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. 생산 균체를 접종할 때의 seed 형태에 따른 영향을 알아보기 위해, 균주를 미분쇄기로 분쇄하여 생산배지에 접종한 경우와 균주를펠맅형태 그대로 생산배지에 접종하여 결과를 비교하였다.
- 생산 균체를 접종할 때의 seed 형태에 따른 영향을 알아보기 위해, 균주를 미분쇄기로 분쇄하여 생산배지에 접종한 경우와 균주를펠맅형태 그대로 생산배지에 접종하여 결과를 비교하였다. 또한 접종량에 따른 생산배지에서의 성장형태와 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 알아보기 위해 0.5 ml (0.6% v/v), 1 ml (1.25% v/v), 2 ml(2.5% v/v)씩 다른 양으로 접종하였다.
- terras의 배양시 용존산소와 미생물의 형태에 영향을 미치는 임펠러의 교반속도 및 pH를 조절하여 최대의 lovastatin 생산량을 나타내는 발효 조건을 확립 하였다. 또한 플라스크 배양에서 L-histidine과 L-tryptophan을 각각 6 g/L의 농도로 첨가한 경우 lovastatin 생산량이 상당히 증가한 결과를 토대로, 상기 두 아미노산의 첨가 시기가 lovastatin 생산에 미치는 영향을 실험하였다. 마지막으로 확립된 최적배양조건에서 회분식 생물반응기를 이용하여 발효한 결과를 발표하고자한다.
- 5 liter로 하였다. 배양온도는 27°C, 공기 유량은 1 vvm(volume of air/volume of fluid/min)로 유지하였으며, 배양시 발생하는 거품을 제거하기 위해 silicon 소포제를 사용하였다. 발효조 배양시 균주의 성장이 활발하여 배양 액상 부의 발효조 벽면, 배양액 상부와 닿는 수소이온농도 측정기나 용존산소농도측정기와 같은 측정기구의 일부분 및 방해판 등에 균체가 붙어서 자라는 경향을 보였다.
- 본 실험을 통해 lovastatin의 생산성 향상을 위해서는 A. terreus의 성장형태가 매우 중요한 요소 중의 하나임을 확인하였으며, 이후의 발효실험에서는 펠맅의 크기를 작고 일정하게 유지하기 위하여 접종량을 l%(v/v)로 하였다.
- 따라서 커다란 펠맅으로 균체가 성장한 경우는 펠맅을 미분쇄기로 분쇄하여 생산배지에 접종하는 방법에 의해 접종 조건이 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. 생산 균체를 접종할 때의 seed 형태에 따른 영향을 알아보기 위해, 균주를 미분쇄기로 분쇄하여 생산배지에 접종한 경우와 균주를펠맅형태 그대로 생산배지에 접종하여 결과를 비교하였다. 또한 접종량에 따른 생산배지에서의 성장형태와 lovastatin 생산성에 미치는 영향을 알아보기 위해 0.
- 2 户m 막으로 여과하였다. 여과액을 표준용액으로 실시한 분석조건과 같은 조건하에서 HPLC를 실행하고 이미 얻어진 검량곡선을 이용하여 생산물의 양을 계산하였다.
- 2 pm 막으로 여과하여 균체를 제거한 발효 여과액을 얻었다. 여과액을 표준용액으로 실시한 분석조건과 같은 조건하에서 HPLC를 실행하고 이미 얻어진 검량곡선을 이용하여 생산물의 양을 계산하였으며, 분석조건은 Table 2와 같다.
- 최적 pH로 결정된 pH 5.8에서 교반속도를 400 rpm 이상으로 조절하면 어떤 결과가 나오는지를 실험하였다 (자료 미제시). 예상대로 500 rpm에서는 전단에 의한 영향으로 pH 5.
- 최적 발효조 운전 조건인 교반속도 400 rpm과 pH 5.8에서, 발효초기에 L-tryptophan 6 g/L가 첨가된 최적 배지를 이용하여 회분식 발효를 수행하였으며, 그 결과를 Figure 5에 나타냈다.
- 회분식 배양에서 교반속도가 미치는 영향을 조사하기 위해 Table 4에 나타낸 것처럼 교반속도를 200, 300, 400 rpm으로 달리하여 lovastatin의 생산량과 발효후 최종 건조균체량을 교하였다.
대상 데이터
- 종배양은 하루 전 배양온도에서 활성화시킨 12 mL의 stock을 80 mL의 배지가 담긴 250 mL 삼각 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 27°C, 200 rpm으로 48시간 배양하였다. 발효조 배양에서 발효조는 2.5 liter 부피의 한국발효기(주)제품을 사용하였고, 조업부피는 1.5 liter로 하였다. 배양온도는 27°C, 공기 유량은 1 vvm(volume of air/volume of fluid/min)로 유지하였으며, 배양시 발생하는 거품을 제거하기 위해 silicon 소포제를 사용하였다.
- 더 좋다는 결과를 보고하였다. 본 발효조 실험에서 사용된 균주는 펠맅형태를 나타냈으며, 펠맅 크기는 1 mm 이하이였다.
- 본 연구에서 사용한 균주는 Aspergillus terreus(ATCC 20542)이며 -70 °C 에서 glycerol stock으로 보관하여 종배양시 마다 새로운 stock을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 균주인 4. wrens의 경우도 배양조건에 따라 두 가지 성장형태를 보이는 것으로 관찰되었으며 성장 배지에서 큰 펠맅으로 성장할 경우 그 종배양액을 생산 배지로 접종할 때 균일한 양의 균체를 접종하기가 어려웠다.
이론/모형
- 측정하였다. Lovastatin의 분석은 Roman Kysilka와 Vladiir Kfen등의 방법(17)을 참고하여 HPLC로 분석하였으며, 분석조건은 Table 1과 같다. Lovastatin 표준용액으로는 순수한 lovastatin을 농도별로 methanol에 용해하여 사용하였고, mevinolinic acid (acid form) 표준용액 (18)은 소량의 methanol에 Lovastatin을 녹인 후 0.
성능/효과
- 8로 유지하였을 때 lovastatin 생산이 최대였으며, 교반 속도보다 pH가 lovastatin 생산에 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. L-tryptophan과 L-histidine의 첨가시기에 따른 lovastatin 생산량을 실험한 결과, 둘다 발효초기부터 첨가하여 배양하는 것이 효과적이었다. L-tryptophan을 발효초기에 첨가한 최적 배지와 최적 환경조건인 교반속도 400 rpm, pH 5.
- L-tryptophan과 L-histidine의 첨가시기에 따른 lovastatin 생산량을 실험한 결과, 둘다 발효초기부터 첨가하여 배양하는 것이 효과적이었다. L-tryptophan을 발효초기에 첨가한 최적 배지와 최적 환경조건인 교반속도 400 rpm, pH 5.8에서 회분식 배양을 수행한 결과 기본배지를 이용하여 실험한 배양 결과보다 약 10배 정도 많은 836 mg/L이었고, 생산성은 3.5 mg/L - hr였다.
- lovastatin 생산에 있어서도 48시간 이후부터 lovastatin의 생산이 완만하게 시작되어 정상상태에서 평균 lovastatin 생산량은 129.89 mg/L로 나타났다. 이 생산량은 200 rpm이나 300 rpm에서 나타난 lovastatin 생산량보다 약 1.
- 이러한 pH의 변화 경향은 Buckland등(24)의 실험에서도 나타났는더], 이때 pH 증가는 glucose가 고갈된 후 균체가 단백질 등을 이용하면서 생기는 암모니아와 같으 대사산물 때문으로 생각된다. pH 7.4에서 같은 교반속도로 수행된 실험에서 보다 건조균체량은 약간 감소하였으나, lovastatin 생산량은 216시간에서 326 mg/L로 pH 7.4에서 수행한 실험보다 2배 이상 높게 나타났다.
- pH를 조절하지 않은 경우와 pH를 5.8로 계속 유지한 경우의 48시간에서의 건조균체량과 lovastatin 생산량을 비교하면, 건조균체량은 pH를 조절하지 앟은 경우가 더 높지만 lovastatin 생산량은 pH를 5.8로 계속 유지한 경우가 2배 이상 높았다. 결국 pH를 5.
- 0 ml)는 펠맅형태로 성장했으나 접종량이 많을 경우 (2 ml)는 균사체 형태로 자라는 것으로 관찰되었다. 각 경우의 균체량과 생산량을 비교해 보면 두 가지 형태의 접종조건에서 각각의 접종량이 증가함에 따라균체량이 함께 증가하는 것을 볼 수 있으며 균사체 형태로 자란 경우보다 펠맅형태로 자란 경우가 lovastatin의 생산성이더 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 0.
- 교반속도를 400 rpm으로 조절한 경우에는 빠른 교반 속도로 인해 200이나 300 rpm에서보다 전단력의 영향으로 균체량이 감소할 것으로 예상하였으나, 정상상태에서 평균 건조균체량이 25 g/L로, 200 rpm이나 300 rpm보다 높게 나타났다. lovastatin 생산에 있어서도 48시간 이후부터 lovastatin의 생산이 완만하게 시작되어 정상상태에서 평균 lovastatin 생산량은 129.
- 균체량의 증가뿐만 아니라 lovastatin 생산량도 매우 증가하여, 240시간에 836 mg/L의 lovastatin 생산량을 나타내었다. 이는 Table 4에 나타낸 기본배지와 교반속도 200 rpm, pH 7.
- Figure 2 에서 보듯이 벽돌색이 나타난 48시간부터 lovastatin의 생산이 급격히 증가하였다. 그 후 60시간부터는 검은 커피색을 나타냈으며, 발효가 진행됨에 따라 발효액의 색이 변함을 관찰할 수 있었다.
- 그리고 펠맅의 형태 도구형의 규칙적인 형태에서 불규칙적인 모양을 나타내었다. 따라서 lovastatin 생산을 위한 발효조 운전조건은 교반속도 400 rpm과 pH 5.8이 적절하다고 판단되었다.
- 각 경우의 균체량과 생산량을 비교해 보면 두 가지 형태의 접종조건에서 각각의 접종량이 증가함에 따라균체량이 함께 증가하는 것을 볼 수 있으며 균사체 형태로 자란 경우보다 펠맅형태로 자란 경우가 lovastatin의 생산성이더 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 0.5 ml과 1 ml의 접종을 비교한 결과 일단 펠맅이 형성되면 펠맅의 크기가 작을 때 더 높은 생산성을 보이는 것으로 나타났다. 이는다른 종류의 이차대사산물을 생산하는 균주에서와 같이 4 terrews의 경우도 균체의 성장형태에 의해 lovastatin의 생합성 능력이 크게 영향을 받는다는 것을 의미하는 결과이다.
- 8로 계속 유지한 경우가 발효초기부터 lovastatin 생산에 유리한 조건을 제공한다는 것을 알 수 있었다. 또한 lovastatin 생산량의 증가정도를 볼 때, 교반속도보다 pH가 lovastatin 생산에 더 많은 영향을 미침을 알 수 있었다.
- 이는 여러 가지 탄소원이 함께 공급되었을 때, 먼저 이용하기 쉬운 탄소원부터 이용한 후에 다음으로 이용하기 쉬운 탄소원을 이용한다는 것을 나타낸다(22). 또한 그렇기 때문에 이차대사산물의 생산시 이처럼 두 가지 이상의 탄소 원을 공급하는 것이 trophophase에서는 이용되기 쉬운 탄소 원이 소비되면서 균체성장이 활발히 일어나 생산물을 생산할 수 있는 균체량을 증가시키고, idiophase에서는 이차 대사산물 생산에 알맞은 탄소원이 소비되면서 이차대사산물이 생산될 수 있어 효율적임을 알 수 있었다.
- 때문에 발효를 시작한 후에 아미노산을 첨가하는 것보다는 처음부터 아미노산을 첨가하는 것이 더 효과적이었다. 발효를 시작한지 6일째에 아미노산을 첨가한 경우에는 lovastatin 생산량과 건조균체량 모두 가장 낮게 나타났다. 이 시기는 균체가 지수기를 지나 정체기에 다다른 시기로, 첨가된 아미노산이 일차대사는 물론 이차대사에도 좋은 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.
- 배양온도는 27°C, 공기 유량은 1 vvm(volume of air/volume of fluid/min)로 유지하였으며, 배양시 발생하는 거품을 제거하기 위해 silicon 소포제를 사용하였다. 발효조 배양시 균주의 성장이 활발하여 배양 액상 부의 발효조 벽면, 배양액 상부와 닿는 수소이온농도 측정기나 용존산소농도측정기와 같은 측정기구의 일부분 및 방해판 등에 균체가 붙어서 자라는 경향을 보였다. 이러한 현상은 교반속도가 낮을수록 심하였으며, Rushton turbine 임펠러의 직경과 발효조의 직경의 비를 0.
- 즉 용존산소에 의한 제한은 없었던 것을 알 수 있다. 이 이후의 모든 실험에서도 용존산소는 200 rpm에서 수행한 것보다 높게 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 이상의 모든 교반속도 조건에서 탄소원으로 공급된 glucose 와 glycerol 중에서 glucose가 먼저 이용되었으며, fucose 소비속도도 빠르게 진행되어 교반속도가 200 rpm 또는 300 rpm 일 때는 48 시간 안에, 400 rpm일 때는 72 시간 안에 glucose가 완전히 고갈되었다. 함께 공급했던 탄소원인 이ycerol은모든 조건에서 glucose가 완전히 고갈되기 전에는 소비가 되지 않았다.
- 이전의 발효조 실험에서 보다 균체성장이 빠르고, 균체량이 많아 발효조의 벽이나 측정기구 등에 균체가 많이 붙는 현상을 보였다. 또한 배양액의 색깔 변화도 빨리 진행되어 발효 초기부터 붉은 갈색에서 36시간에 짙은 벽돌색을 나타냈으며, 60시간부터는 검은 커피색을 나타내었다.
- ammz/w의 경우 균주가 펠맅모양으로 성장할 때 더 높은 생산성을 보인다고 보고하였는데, 이들은 균사체형태와 펠맅형태로 성장할 때의 이러한 생산성의 차이를 각각의 산소전달계수를 비교하여 그 이유를 설명하였다. 즉 배양액의 점도가 매우 높은 균사체 형태로 균주가 성장할 경우 산소전달계수가 낮아서 mevastatin의 생산에 필수적인 산소 전달이 제한을 받게 되며 펠맅형태로 성장할 경우는 반대로 낮은 점도로 인한 높은 산소전달계수 현상때문에 산소의 전달이 용이했던 것이 mevastatin 생산성 증가의 주된 요인이라고 설명하였다.
- 조사하였다. 최적 교반속도는 400 rpm이었고 pH는 5.8로 유지하였을 때 lovastatin 생산이 최대였으며, 교반 속도보다 pH가 lovastatin 생산에 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. L-tryptophan과 L-histidine의 첨가시기에 따른 lovastatin 생산량을 실험한 결과, 둘다 발효초기부터 첨가하여 배양하는 것이 효과적이었다.
- 8로 계속 유지한 경우는 Figure 2에 나타내었다, pH를 조절하지 않은 경우보다 건조균체량과 lovastatin 생산량 둘 다 증가하였다. 특히 lovastatin 생산량은 216시간에 598 mg/L로 pH 7.4에서 실험한 것보다는 약 4배, pH를 조절하지 않은 실험에서 보다 약 1.8배 향상되었다.
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