[논문]폐동맥내피 세포에서 <tex>$H_2O_2$</tex>에 의한 세포자사

김범식; 정주호

문제 정의

그리고 본 연구에서는 비교적 정확하게 초기단계의 세포자사를 판별하고 세포자사와 괴사를 식별할 수 있는 flow cytometry를 이용하여 세포자사를 확인하고자 하였다. 세포자사가 발생하면 flow cytometry 상에서 정상 세포주기에 있는세포 수가 감소하고 세포자사가 일어난 세포에서 작은 분자량의 DNA 단편들이 세포막의 변화로 이동하여 sub-Gi peak 를 보인다고 하였다11).
H2O2는 내인성으로 생성되는 활성 산소군(reactive oxygen species) 의 하나로 여러 산화성스트레스와 관련된 질환에서 세포의 손상과 세포자사에 관련되는 것으로 알려져 있다6). 본 실험은 이러한 폐혈관 손상에 대한 산화성 스트레스와의 관련 정도를 알아보기 위하여, 배양한 CPAE 세포에 산화성 스트레스를 일으키는 H2O2를 투여한 후, H₂O₂에 의한 세포독성을 관찰하고, 폐혈관 손상기전의 하나로 생각되고 있는 세포자사가 유발되는 지를 연구하였다.
17). 본 연구에서는 이러한 핵들의 변화를 관찰하기 위해 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색액인 DAPI를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였으며, 정상 대조군에 비해 50 J1M H2O2로 처치한 CPAE 세포에서 핵분절 등의 전형적인 세포자사 형태를 나타내었다.
또한 혈관내피 세포는 혈압과 국소혈류량의 조절에 관계하고 있으며", 이러한 내피세포는 물리적인 자극 및 혈관 평활근 수축에 영향을 미치는 화학적 신호전달에 반응한다고 알려져 있다8). 이에 본 연구에서는 배양한 소의 폐동맥내피 세포에 산화성 스트레스를 유발한다고 알려진 H2O2를 투여 하여 . 폐 혈관세포의 손상 기 전의 하나로 생각되는 세포자사를 유발하는지를 연구하고자 하였다.
이에 본 연구에서는 배양한 소의 폐동맥내피 세포에 산화성 스트레스를 유발한다고 알려진 H2O2를 투여 하여 . 폐 혈관세포의 손상 기 전의 하나로 생각되는 세포자사를 유발하는지를 연구하고자 하였다.

제안 방법

은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포의 배양은 20% FBS가 포함된 DMEM 용액에 5% CO₂, 95% 습도, 37℃ 온도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였고, 배양액은 2일마다 교환하였다 "
배양하였다. 4% paraformaldehyde(PFA)를 첨가하여 세포를 고정시킨 후, 75% ethan이에서 5분, 90% ethanol에서 5분, 95% ethanol에서 5분, 100% ethanol에서 5분간(2회) 탈수 시키고, xylene으로 처리 후 coverglass로 봉입한 다음 광학 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또는 CPAE 세포를 60 mm 배양접시에 배양한 후 도립현미경 (Nikon, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
CPAE 세포를 5X106개의 세포수가 되도록 분주한 후, H₂O₂를 형태학적 관찰과 같은 방법으로 처치하였다. 3시간배양 후 세포를 배양액과 모은 후 200Xg에서 10분간 원심분리를 하였다.
CPAE 세포를 chamber slide(Nalge Nunc International, USA) 에 well당 5X104의 세포수가 되도록 분주하고 배양액 500 ㎕를 첨가한 후, H₂₆의 최종 농도가 50 μM이 되도록 처치하였고 H2O2를 처치하지 않은 세포군을 대조군으로 3시간동안 배양하였다. 4% paraformaldehyde(PFA)를 첨가하여 세포를 고정시킨 후, 75% ethan이에서 5분, 90% ethanol에서 5분, 95% ethanol에서 5분, 100% ethanol에서 5분간(2회) 탈수 시키고, xylene으로 처리 후 coverglass로 봉입한 다음 광학 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
CPAE 세포에서 H2O2가 세포독성을 일으킬 수 있는 농도를 알아보고자, H2O2의 최종 농도가 10 μM, 50 μM, 100 fl M, 500 μM 처치한 각각의 CPAE 세포를 1시간, 3시간 및 5 시간 배양하였고, H2O2를 처치하지 않은 세포군을 대조군으로 하여 MTT 분석을 시행하였다. 각 시간 및 농도별 세포독성은 실험방법에 기재한 세포생존율로 산출하였으며, 대조군의 세포생존율을 100%로 하여 상대 비교하였다.
Chamber slide에 CPAE 세포와 H₂O₂를 형태학적 관찰과 같은 방법으로 처치한 후, Intergen(USA) 회사의 ApopTag8 in situ apoptosis detection kit를 사용하여 제조회사의 실험방법대로 시행흐]였다. 먼저 배양액을 제거하고 phosphate- buffered saline(PBS)로 3회 세척 후 4% PFA로 실온에서 10분간 세포들을 고정하였다.
3). DAPI staining에서는 세포핵에 특이적으로 염색되는 DAPI 처리 후 형광현미경으로 관찰하였으며, H₂O₂ 처치시 핵응축, DNA 절편과 핵주변에 작은 세포자사소체(apDptotic body)가 형성되었다(Fig. 3). Eow cytometry 분석시 50 11M로 처치한 실험군에서 대조군에 비해 세포주기중 sub-Gi 이 증가하였으며, G, peak가 감소하였다(Fig.
하여 MTT 분석을 시행하였다. 각 시간 및 농도별 세포독성은 실험방법에 기재한 세포생존율로 산출하였으며, 대조군의 세포생존율을 100%로 하여 상대 비교하였다. 실험 결과, H2O2를 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM 농도로 1 시간동안 처치한 세포의 생존율은 각각 약 81.
4% paraformaldehyde(PFA)를 첨가하여 세포를 고정시킨 후, 75% ethan이에서 5분, 90% ethanol에서 5분, 95% ethanol에서 5분, 100% ethanol에서 5분간(2회) 탈수 시키고, xylene으로 처리 후 coverglass로 봉입한 다음 광학 현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또는 CPAE 세포를 60 mm 배양접시에 배양한 후 도립현미경 (Nikon, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
PBS로 3회 세척후 anti-digoxigenin peroxidase 65 ㎕/5 err?를 점적 후 습도를 유지하면서 실온에서 30분간 반응시키고, PBS로 4회 세척하였다. 발색제로는 0.02% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochlo- ride(DAB)과 0.003% H2O2가 혼합된 용액을 사용하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 광학현미경으로 관찰하였다.
최근 세포자사와 괴사와의 구분이 모호해지고 세포 사멸시 두 기전이 공존하여 나타나는 경우도 있고, 세포자사를 규명하는 실험방법들이 전적으로 특이적이지 않다는 점을 감안하여, 본 연구에서는 세포자사의 다양한 형태학적 특징이나 생화학적 특징 등을 이용한 여러가지 방법을 사용하여, CPAE 세포에서 H2O2의 세포독성시 세포자사가 일어나는지를 확인하였고, 모든 실험결과에서 일관되게 세포자사의 특징적인 소견을 나타내었다.
폐혈관 손상 기전의 하나로 추측되고 있는 산화성 스트레스에 의한 세포자사를 연구하고자, 소에서 유래한 폐동맥혈관내피 세포에 산화성 스트레스를 유발하는 H2O2를 투여하였다. 실험결과, H2O2는 폐동맥혈관내피 세포에서 세포독성를 유발하였다.

대상 데이터

세포 배양액은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 과 fetal bovine serum(FBS) 등은 GibcoBRL(USA)에서 구입하였으며, propidium iodide(PI) 와 4, 6-diamdino-2-phenylindole (DAPI) 는 Sigma (USA), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl- tetrazolium bromidefMTT) kit는 Roche(Germany)에서, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay는 Intergen(USA) 회사의 ApopTag'® in situ apoptosis detection kit를 사용하였으며, 일반 시약은 Sigma 제품을 이용하였다.
실험에 사용한 세포주는 소의 폐혈관내피 세포(CPAE; calf pulmonary arterial endothelial cells)로 폐동맥의 수죽, 이완기전, 약물 반응 등의 연구에 널리 사용되는 세포주이며, 한국세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다. 세포의 배양은 20% FBS가 포함된 DMEM 용액에 5% CO₂, 95% 습도, 37℃ 온도가 유지되는 세포 배양기에서 배양하였고, 배양액은 2일마다 교환하였다 "

데이터처리

MTT cytotoxicity assay의 결과는 분산 분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)을 이용하였고, 통계적인 유의성은 p<0.05 로 하였다.
모든 실험값은 평균값土표준오차로 하였고, 통계학적 분석은 SAS(Statistic Analysis System) program을 이용하였다. MTT cytotoxicity assay의 결과는 분산 분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)을 이용하였고, 통계적인 유의성은 p<0.

이론/모형

CPAE 세포의 H₂O₂ 농도에 의한 세포독성을 측정하기 위하여, 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase가 기질 MIT를 검푸른 색깔의 formazan으로 변환시키는 원리를 이용한 Roche(Germany) 회사의 MTT assay kit를 사용하였다. 세포독성은 ELISA reader로 595 nm과 690 nm에서 측정한 후, 다음의 산출식에 의해 세포 생존율로 나타내었다.
Dose-dependent effect of H₂O₂ on cell viability. Cellular viability was determined by an MTT assay. Relative viability(% control) is shown as the percentage absorbance of the sample with respect to that of the controKwithout H₂O₂).

성능/효과

3). Eow cytometry 분석시 50 11M로 처치한 실험군에서 대조군에 비해 세포주기중 sub-Gi 이 증가하였으며, G, peak가 감소하였다(Fig. 3). 이상의 형태학적 소견과 생화학적 소견들은 세포자사에서 일어나는 특징적인 소견들이며, 따라서 H2O2 50 pM 투여시 CPAE 세포에서 세포자사가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
3±L3이었다. H2O2를 처치한 실험군에서 시간별, 농도별 모두 대조군에 비해 유의하게 세포독성을 나타내었고 세포독성은 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보였다(Fig. 1). 이러한 결과를 토대로 추후 실험들에서의 H2O2는 50 μM의 농도로 3시간을 처치하였다.
발색기질로 DAB을 사용하였다. 따라서 TUNEL(+) 세포들은 흑갈색으로 염색되어 광학 현미경으로 관찰할 수 있으며, 50 μM의 H₂O₂ 처치한 CPAE 세포에서 핵염색질이 응축되고 DNA 절편이 생성되는 흑갈색으로 염색된 TUNEL(+) 세포들이 관찰되었다(Fig. 3). DAPI staining에서는 세포핵에 특이적으로 염색되는 DAPI 처리 후 형광현미경으로 관찰하였으며, H₂O₂ 처치시 핵응축, DNA 절편과 핵주변에 작은 세포자사소체(apDptotic body)가 형성되었다(Fig.
본 연구에서도 CPAE 세포에 50 J1M H₂O₂ 처치 시 이러한 형태학적 특징이 관찰되었다. 또한 MTT를 이용한 세포독성 실험 결과에서 H₂O₂를 10 11M, 50 ]1 M, 100 J1M, 500 uM 농도로 투여한 1시간, 3시간 및 5시간 실험군에서 모두 유의한 세포독성을 나타내었고, 농도 의존적이었다.
실험결과, H2O2는 폐동맥혈관내피 세포에서 세포독성를 유발하였다. 또한 TUNEL assay, DAPI staining 및 flow cytometry 분석 등을 통하여 H2O2에 의한 폐동맥혈관내피 세포의 손상은, 형태학적 소견 및 생화학적인 소견에서 세포자사의 특징적인 소견을 나타내었다.
세포자사가 발생하면 flow cytometry 상에서 정상 세포주기에 있는세포 수가 감소하고 세포자사가 일어난 세포에서 작은 분자량의 DNA 단편들이 세포막의 변화로 이동하여 sub-Gi peak 를 보인다고 하였다11). 본 연구결과에서도 50 pM H₂O₂로 처치한 CPAE 세포에서 세포주기 중 sub-Gi이 증가하고 G이 감소된 세포자사에 나타나는 소견을 보였다.
이러한 DNA 분절은 초기에는 DNA가 300 kb 또는 50 kb 크기로 절단된 후, 핵산분해효소의 계속적 활성화에 의해 oligonucleosome 크기의 DNA 분절을 만들고, 결국 180-200 bp의 DNA 분절들을 나타낸다고 하였다16). 본 연구에서는 이러한 DNA 분절을 확인하기 위하여 세포자사를 일으킨 세포에 특이적으로 존재하는 단편화된 DNA의 유리 3, -OH 말단을 terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용하여 염색하는 TUNEL assay를 사용하였으며, 50 J1M H₂O₂로 처치한 실험군에서 TUNEL(+) 세포들이 관찰되어 세포자사가 일어났음을 확인할 수가 있었다.
각 시간 및 농도별 세포독성은 실험방법에 기재한 세포생존율로 산출하였으며, 대조군의 세포생존율을 100%로 하여 상대 비교하였다. 실험 결과, H2O2를 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM 농도로 1 시간동안 처치한 세포의 생존율은 각각 약 81.5+4.7, 35.1+6.6, 24.5+2.9, 25.7±2.9이었고, 3시간에서는 각각 70.3+6.1, 33.1±1.8, 25.9+2.6, 28.3±3.5로 나타났으며, 5시간에서는 각각 62.6±12.3, 36.3+4.9, 28.5±5.1, 24.3±L3이었다. H2O2를 처치한 실험군에서 시간별, 농도별 모두 대조군에 비해 유의하게 세포독성을 나타내었고 세포독성은 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보였다(Fig.
3). 이상의 형태학적 소견과 생화학적 소견들은 세포자사에서 일어나는 특징적인 소견들이며, 따라서 H2O2 50 pM 투여시 CPAE 세포에서 세포자사가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
형태학적 변화는 H₂O₂ 처치시 세포의 수축과 세포질이 응축이 나타났으며, 배양접시의 바닥으로부터 분리되어 각각의 세포가 둥근 형태로 크기가 작아진 소견을 보여주었으며(Fig. 2), 이러한 형태학적 변화들은 세포자사의 특징적인 형태학적 소견들과 일치하였다.

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

폐동맥내피 세포에서 $H_2O_2$에 의한 세포자사
$H_2O_2$ Induces Apoptosis in Calf Pulmonary Artery Endothelial Cells 원문보기

초록
AI-Helper

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

제안 방법

대상 데이터

데이터처리

이론/모형

성능/효과

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

연합인증

폐동맥내피 세포에서 $H_2O_2$에 의한 세포자사 $H_2O_2$ Induces Apoptosis in Calf Pulmonary Artery Endothelial Cells 원문보기

초록 용어보기논문에서 용어와 풀이말을 자동 추출한 결과로, 시범 서비스 중입니다. AI-Helper

주제어

AI 본문요약 엑셀 다운로드 AI-Helper

문제 정의

제안 방법

대상 데이터

데이터처리

이론/모형

성능/효과

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

김범식 (29) 정주호 (82)

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

폐동맥내피 세포에서 $H_2O_2$에 의한 세포자사
$H_2O_2$ Induces Apoptosis in Calf Pulmonary Artery Endothelial Cells 원문보기

초록
AI-Helper

AI 본문요약
AI-Helper