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문제 정의
- 본 연구는 천연색소로 이용되는 자근으로부터 혈소판 활성화 억제작용을 통해서 기능성 식품으로 개발하고자 추출, 분리, 정제한 분획물로부터 혈소판 작용을 검색하여 유효성분을 동정하고자 한다.
가설 설정
- 최근 선진국의 조사에 의하면 혈관 순환기계 질환이 현대인 사망원인 중 1위를 차지하고 있으며, 우리나라 통계 보고에서도 선진국에서와 마찬가지로 사망자수 및 원인에 있어서 악성종양보다는 뇌혈관 질환과 심장질환이 큰 비중을 차지하는 것으로 조사되고 있다.2) 이러한 뇌 · 심혈관 질환의 직접적인 원인은 혈소판의 응집력 항진에 기인한다. 따라서 혈소판은 뇌심혈관계 질환이나 혈전증을 연구하는데 유용하다고 할 수 있다.
제안 방법
- EtOAc추출물에서 얻은 분획물에서 최종적으로 활성을 나타내는 물질을 Thin layer chromatography(Hexane : EtOAc = 5:1의 전개용매)로 확인하고 High performence liquid chromatography(intersil ODS prep 10X 250 rrun)로 유효성분을 분리 정제하였다. 정제된 각 화합물의 구조는 1H과 13C-핵자기공명 (NMR, Bruker) 스펙트라에 의해 결정하였다.
- 5)에 채혈한 후, 250xg로 10분간 원심분리한다. 상등액 (platelet-rich plasma)을 분리한 후 침전물(platelet- rich pellet)을 Tyrode HEPES buffer pH 6.35용액으로 두 번 세척한 후, 마지막으로 Tyrode differ pH 7.35 용액으로 부유하여 washed platelet를 조제하였다. 혈소판 수를 광학현미경으로 계측하여, 혈소판 수가 5×l08/ml가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다.
- 24로 나타났다. 이러한 II과 III 분획물 및 n-hexane 재추출물을 분리 · 정제하고자 HPLC으로 Figure 1에서와 같이 8.6분, 9.6분, 11.4분, 12.5분, 14.0분의 5개 peak를 분리하여 Table 3에서 1H-과 13C-NMR (CDCI3) 스펙트라로 구조를 확인하였다.
- 자근색소 추출물중 비교적 강한 활성을 갖는 n-hexane 재추출물과 ethyl acetate 추출물에서 유효성분을 분리하고자 silicagel 컬럼으로 4개 분획물로 분획하였다. 각 분획물의 혈소판 억제작용은 Table 2와 같이 collagen의 응집작용에 대하여 II과 III 분획물이 각각 100%와 91% 억제율을 나타났지만 I과 IV 분획물은 나타나지 않았다.
- ODS prep 10X 250 rrun)로 유효성분을 분리 정제하였다. 정제된 각 화합물의 구조는 1H과 13C-핵자기공명 (NMR, Bruker) 스펙트라에 의해 결정하였다.
- 최근 동물성 식품 및 지방 섭취 증가로 인한 현대인의 식생활 변화로 혈소판 활성화가 직접적 원인인 뇌 · 심혈관질환의 사망률이 증가되고, 성인병 예방과 치료의 대처방안으로 식품의 기능성에 대한 관심이 높아짐에 따라서 천연착색료이며 항균, 항암 작용이 있는 자근(Lithospermum erythrorhizon)으로부터 추출, 분리 · 정제한 분획물에서 혈소판 활성화 억제작용이 있는 생리활성물질을 분리 · 동정하였다. 자근에서 methanol, n-hexane, ethyl acetate 등의 용매 추출물과 methanol 추출물에 NaOH로 처리한 n-hexane 추출물에 대한 혈소판 응집 억제작용은 collagen의 응집작용에 대하여 n-hexane 재추출물이, thrombin의 응집작용에 대하여 ethyl acetate주출물이 큰 억제작용을 보였고, 이러한 추출물에서 컬럼 및 HPLC로 분리 · 정제한 5개 물질의 화학구조를 1H과 13C-NMR 스펙트라 분석한 결과 shikonin, acethylshikonin, isobutylshikonin, a-methyl-n-butylshikonin, β,β-dimethylacrylshikonin을 확인하였고, 혈소판 응집 억제작용은 β,β-dimethylaciylshikonin≥a-methyl-n-butylshikonin>isobutylshikonin>acetylshikonin>shikonin 순으로 나타났다.
대상 데이터
- 혈소판 수를 광학현미경으로 계측하여, 혈소판 수가 5×l08/ml가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다. Tyrode HEPES용액의 조성은 138.3 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.048 mM MgCl2 6H2O, 4.0 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.35% Albumin(BAS), 0.1% glucose이다.(2)
- Co에서 구입하였다. 분석용 시약으로는 HPLC용 methanol (Fisher chemical, HPLC Grade)을 사용하였고, Column chromatography용 silical gel은 kieselgel 60 (70- 230mesh, Merck 7734) 및 kieselgel 60 (230-400mesh, Merck 9385)를 사용하였으며 TLC plate는 Kieselg이 60F254 (Merclc art 5554)를 사용하였다. 본 실험에 사용한 모든 용매는 증류하여 사용하였고, 그 외의 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 혈소판 활성화에 사용되는 시약 중 collagen, thrombin은 Chrono Co에서 구입하였다. 분석용 시약으로는 HPLC용 methanol (Fisher chemical, HPLC Grade)을 사용하였고, Column chromatography용 silical gel은 kieselgel 60 (70- 230mesh, Merck 7734) 및 kieselgel 60 (230-400mesh, Merck 9385)를 사용하였으며 TLC plate는 Kieselg이 60F254 (Merclc art 5554)를 사용하였다.
성능/효과
- 96분의 peak는 1H-NMR 분석에서 C11 의 H는 8 6.0 (1H, dd. 4.4, 7.3, methine), 2.14(3H, s, methyl), C11의 OH에 acethykshikonin 유도체로, 11.4분의 peak는 1H-NMR 분석에서 Cll의 H는 8 6.0(lH, dd, 4.4, 7.3, methine), 2.5(1H, m, methine), 1.23, 1.25(3H×2, s, methyl), Cll의 OH에 isobutyl- shikonin 유도체로, 12.5분의 peak는 1H-NMR 분석에서 Cll의 H는 8 6.0(lH, dd, 4.4, 7.3, methine), 2.5(1H, m, methine), 1.23, 1.25(3H×2, s, methyl), Cll의 OH에 oc-methyl-n-butyl- shikonin 유도체로 확인하였으며 12.5분의 peak는 a-methyl-n-butyl- 과 β,β-dimethylacryl- shikonin 유도체가 2 : 1비율로 혼합되어 있음을 확인하였다. 이와 같이 자근색소의 화학구조는 shikonin을 기본골격으로 하여 C11 에 위치한 R기에 따라서 acethyl-, isobutyl-, a-methyl-n-butyl-, β,β-dimethylacryl- shikonin 유도체들로 확인되었다(Figure 2).
- 각 분획물의 혈소판 억제작용은 Table 2와 같이 collagen의 응집작용에 대하여 II과 III 분획물이 각각 100%와 91% 억제율을 나타났지만 I과 IV 분획물은 나타나지 않았다. Thrombin의 응집작용에 대하여 II, III, I, IV 분획물 순으로 각각 96%, 84%, 58%, 17% 억제율을 나타났다.
- Thrombin의 응집작용에 대하여 각 추출물 l00㎍/ml 에서 methanol을 제외한 n-hexane, ethyl acetate, n-hexane 재추출물은 100% 억제되었고, 10㎍/ml에서 ethylacetate 추출물만이 100% 억제작용을 나타났다. 이러한 자근색소의 n-hexane 재추출물과 ethylacetate 추출물에서 혈소판 응집작용이 강하게 억제되었지만 collagen 및 thrombin의 응집 작용에 대하여 각각 다른 억제율을 나타났다.
- silicagel 컬럼으로 4개 분획물로 분획하였다. 각 분획물의 혈소판 억제작용은 Table 2와 같이 collagen의 응집작용에 대하여 II과 III 분획물이 각각 100%와 91% 억제율을 나타났지만 I과 IV 분획물은 나타나지 않았다. Thrombin의 응집작용에 대하여 II, III, I, IV 분획물 순으로 각각 96%, 84%, 58%, 17% 억제율을 나타났다.
- Thrombin의 응집작용에 대하여 각 추출물 l00㎍/ml 에서 methanol을 제외한 n-hexane, ethyl acetate, n-hexane 재추출물은 100% 억제되었고, 10㎍/ml에서 ethylacetate 추출물만이 100% 억제작용을 나타났다. 이러한 자근색소의 n-hexane 재추출물과 ethylacetate 추출물에서 혈소판 응집작용이 강하게 억제되었지만 collagen 및 thrombin의 응집 작용에 대하여 각각 다른 억제율을 나타났다.
- Thrombin 의 응집 작용에 대하여 10㎍/ml에서 β,β-dimethylacryl- = a-methyl-n-butyl- = isobutyl- = acetyl->shikonin 유도체 순으로 나타났고 1 ㎍/ml에서 acetyl-≥ β,β-dimethylacryl- = a-methyl-n-butyl-> isobutyl->shikonin 유도체 순으로 나타났다. 이러한 혈소판 응집 억제작용은 shikonirr을 기본골격으로 하여 C11 에 위치한 R기에 따라서 활성이 다르게 나타내며 aliphatic hydroxy 기의 탄소 수가 증가할수록 작용도 증대되었다. 작용 증대는 11번 탄소에 치환된 탄소수가 화학구조 활성 상관성에 크게 관여한다고 사료된다.
- 자근에서 methanol, n-hexane, ethyl acetate 등의 용매 추출물과 methanol 추출물에 NaOH로 처리한 n-hexane 추출물에 대한 혈소판 응집 억제작용은 collagen의 응집작용에 대하여 n-hexane 재추출물이, thrombin의 응집작용에 대하여 ethyl acetate주출물이 큰 억제작용을 보였고, 이러한 추출물에서 컬럼 및 HPLC로 분리 · 정제한 5개 물질의 화학구조를 1H과 13C-NMR 스펙트라 분석한 결과 shikonin, acethylshikonin, isobutylshikonin, a-methyl-n-butylshikonin, β,β-dimethylacrylshikonin을 확인하였고, 혈소판 응집 억제작용은 β,β-dimethylaciylshikonin≥a-methyl-n-butylshikonin>isobutylshikonin>acetylshikonin>shikonin 순으로 나타났다. 이상의 결과로부터 자근색소의 생리활성은 shikonin 유도체이며 11번 탄소에 치환된 aliphatic 기의 탄소수가 많을수록 억제작용이 강하게 나타난다고 사료된다.
- 활성화 억제작용이 있는 생리활성물질을 분리 · 동정하였다. 자근에서 methanol, n-hexane, ethyl acetate 등의 용매 추출물과 methanol 추출물에 NaOH로 처리한 n-hexane 추출물에 대한 혈소판 응집 억제작용은 collagen의 응집작용에 대하여 n-hexane 재추출물이, thrombin의 응집작용에 대하여 ethyl acetate주출물이 큰 억제작용을 보였고, 이러한 추출물에서 컬럼 및 HPLC로 분리 · 정제한 5개 물질의 화학구조를 1H과 13C-NMR 스펙트라 분석한 결과 shikonin, acethylshikonin, isobutylshikonin, a-methyl-n-butylshikonin, β,β-dimethylacrylshikonin을 확인하였고, 혈소판 응집 억제작용은 β,β-dimethylaciylshikonin≥a-methyl-n-butylshikonin>isobutylshikonin>acetylshikonin>shikonin 순으로 나타났다. 이상의 결과로부터 자근색소의 생리활성은 shikonin 유도체이며 11번 탄소에 치환된 aliphatic 기의 탄소수가 많을수록 억제작용이 강하게 나타난다고 사료된다.
- 자근에서 분리 · 정제하여 화학구조를 확인한 shikonin 유도체의 혈소판 억제작용은 collagen의 응집작용에 대하여 10㎍/ml 농도에서 β,β-dimethylacryl- = a-methyl- n-butyl- = isobutyl- = acetyl->>>shikonin 유도체 순으로 나타났고, 1 ㎍/ml 농도에서 β,β-dimethylacryl- = a-methyl-n-butyl->>>isobutyl- = acetyl- = shikonin 유도체 순으로 나타났다. Thrombin 의 응집 작용에 대하여 10㎍/ml에서 β,β-dimethylacryl- = a-methyl-n-butyl- = isobutyl- = acetyl->shikonin 유도체 순으로 나타났고 1 ㎍/ml에서 acetyl-≥ β,β-dimethylacryl- = a-methyl-n-butyl-> isobutyl->shikonin 유도체 순으로 나타났다.
- 혈소판의 collagen 및 thrombin 활성화 및 응집작용에 자근의 methanol, n-hexane, ethyl acetate 주출물과 alkali로 처리한 n-hexane 재추출물에 대한 혈소판 억제 작용은 Table 1과 같이 collagen의 응집작용에 대하여 각 추출물 100㎍/ml 농도에서 methanol을 제외한 n-hexane, ethyl acetate, n-hexane 재추출물은 100% 억제되었고, 10㎍/ml 농도에서는 n-hexane 재추출물만이 100% 억제작용을 나타났다. Thrombin의 응집작용에 대하여 각 추출물 l00㎍/ml 에서 methanol을 제외한 n-hexane, ethyl acetate, n-hexane 재추출물은 100% 억제되었고, 10㎍/ml에서 ethylacetate 추출물만이 100% 억제작용을 나타났다.
후속연구
- 작용 증대는 11번 탄소에 치환된 탄소수가 화학구조 활성 상관성에 크게 관여한다고 사료된다.(6) 그러므로, 혈소판 작용에 대한 자근색소 shikonin 유도체의 이러한 활성 상관성은 세포내에서 어떠한 작용 기전을 갖는지를 앞으로 연구하고자 한다.17,19)
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