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문제 정의
- 따라서 본 연구는 RAPD 분석 을 통한 DNA 다형현상을 이용하여 가시오갈피의 자생 지역에 따른 변이 정도와 가시오갈피와 오갈피의 변이 정도를 검토하고자 수행 하였다.
제안 방법
- DNA 증폭은 Williams 등(1990)의 방법을 수정하여 수행하였다. DNA 증폭은 0.5ml의 effendorf tube를 사용하여서 총 25μl의 반응혼합물 (template DNA 10ng, 0.5mM primer, 200μM dNTP, 10 × buffer with MgCL, lunit Taq polymerase)을 조성 하여 TOUCHDOWNTM(HYBRID)을 이용하여 45회의 증폭을 수행 하였다.
- USA에서 구입 하여 서 사용하였다(Table 1). DNA 증폭은 Williams 등(1990)의 방법을 수정하여 수행하였다. DNA 증폭은 0.
- PCR 증폭은 초기 denaturing 단계 를 951? 에 서 5분간 실행했고 최종 신장단계는 72P에서 10분간 지속시키고 종결하였으며, 증폭은 94P 에서 1분간 denaturing과정 과 45℃에서 1 분간 annealing, 그리 고 7213에서 2분간 extending과정을 1회로 하여 45회 증폭을 수행하였다. 전기영동에 사용된 gele 1-5% agarose gel로 하였고 12QV에서 1.
- 동량의 Chloroform : isoamylalchol(49:l)용액을 첨가한 후 5000rpm에 서 15분간 원심 분리 한 후 상층 액을 취하여 새로운 centrifuge tube에 넣은후 동량의 isopropanol을 넣고 DNA를 침전시켰고 이를 10, 000rpm에서 15분 동안 원심분리를 하였다. 이어서 pellet을 70% EtOH로 세척과정을 거친후 실온에서 약 1 시 간 정 도 건조 시 키 고 이 에 다시 TE buffer(10mM Tris-HCl, 2mM EDTA pH 8.0) 150#, 로 pellet을 녹인후 RNase A를 첨 가하고 37℃의 water bath에서 1시 간동안 incubation한 다음 0.8% agarose gel에서 전기영 동하여 추출된 DNA를 확인하였다. 추출한 DNA의 농도를 알아보기 위 하여 Hitach U-2001 Spectrophotometer를 사용, 정 량분석을 실시하여 최 종농도가 5ng/ml가 되 도록 희 석 하였다.
- 수행하였다. 전기영동에 사용된 gele 1-5% agarose gel로 하였고 12QV에서 1.5시 간동안 진행시킨 후 EtBr(ethidium bromide)로 염 색 하여 UV를 통해 DNA band를 확인하였고 Polaroid film을 사용하여 사진으로 기 록하였다.
- 8% agarose gel에서 전기영 동하여 추출된 DNA를 확인하였다. 추출한 DNA의 농도를 알아보기 위 하여 Hitach U-2001 Spectrophotometer를 사용, 정 량분석을 실시하여 최 종농도가 5ng/ml가 되 도록 희 석 하였다.
대상 데이터
- 가시 오갈피 및 오갈피 의 수집 종 내 유연 관계 를 분석하기 위하여 지리적으로 원거리에 있는 일본 북해도, 러 시 아, 중국에 자생하는 가시 오갈피 와 국내에서는 춘천, 태기산, 잠곡, 오대산 등 8개 지역에서 수집한 8개체와 오갈피 속의 서울오갈피와 지리 오갈피에서 추출한 genomic DNA를 10개의 염기서열로 구성 된 Oligonucleotide primer 60종으로screening하여 그 중 band의 재연성과 선명도가 높은 10개의 primer를 선발하였다(Fig. 1).
- 실험재료는 1990년부터 1996년에 가시오갈피의 국가별(일본, 러시아, 중국), 지 역별 수집종(태기산, 잠곡, 오대산, 춘천, 영월)과 2 개의 오갈피 종(E. seoulense, E. chiisanesis)을 수집 하여 총 10종을 대 상으로 하였 다.
이론/모형
- 가시 오갈피 모집 종간의 유연관계를 분석 하기 위한 RAPD 분 석 에 서 DNA의 추 출 은 CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide)방법 을 사용하였다. 각각의 모집종의 잎을 2~3매 채취하여 액체질소가 들어 있는 막자사발에 넣고 갈아서 CTAB 용액이 들어 있는 튜브에 넣고 시료와 CTAB용액이 잘 섞이도록 흔들어 준 후에 60P에서 1시간동안 처리한다.
- 유연 관계 분석 은 NTSYS(Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) computer program의 UPGMA(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic average) 분석 방법 (Rohlf, 1989)을 이 용하여 dendrogram을 작성 하였 다.
성능/효과
- 10개의 primer를 사용하여 얻은 106개의 밴드를 각각 하나의 형질(character)로 보아 이를 유연관계를 분석한 결과(Fig. 2) 크게는 2개의 group, 즉 영월수집 종과 일본종 및 지 리산 오갈피와 서울 오갈피를 포함하는 군(Group 1 )과 국내종과 러시 아종, 중국 종을 포함하는 군(Group U)으로 나뉘 어졌다.
- 가시오갈피 와 오갈피의 전체 수집 개체들의 유사도는 0.41 에서부터 0.92로 나타났고, genetic distance 값의 평균은 0.61 이 었다(Table 2).
- 유사도를 기준으로 수집 개체사이의 원연관계를 분류했을 때 0.50을 기준으로 2군으로 분류되었으며, 1군으로 분류된 북해도가시 오갈피는 국내의 각 수집지 역 의 가시 오갈피 나 러시아 가시오갈피와 원연의 관계인 것으로 나타났으며 1군으로 분류된 지리산 오갈피나 서울 오갈피와 0.52~0.61 의 유사도를 나타내 어 이 들 오갈피 종들이 국내산이나 러시아, 중국 가시오갈피와 원연의관계를 나타내었다. 한편 2군으로 분류된 개체들의 유사도는 0.
- 증폭된 DNA 단편들은 지역에 따라 개체간에 동일하거나 서로 다른 밴드 양상을 보였으며 10개의 primer를 사용하여 얻을 수 있는 총 밴드 수는 106개 였으며 이 중 monomorphic 한 밴드는 17.9%에 해당하는 19개였으며 나머지 87 개는 polymorphic한 것으로 나타났다. 10개체 모두에서 증폭이 일어난 10개의 primer는 G+C의 수가 DNA 증폭에 영 향을 준다는 보고(Fitsch 등, 1993) 와같이 G+C의 수가 모두 60%이상이 었다(Table 1).
후속연구
- 본 연구 결과 국내종과 함께 인접국가와 분포지별 수집 종을 대상으로 하였기 때문에 보다 정 확한종내변이와 유연관계를 파악할 수 있다고 사료되며 보다 정 확한 결과를 얻기 위 하여 specific primer를 사용한 분석과 동위효소 분석 등과 같은 좀더 세밀한 분 자생 물학적 접 근방법 이 수행 되 어 져 야 할 것 이 다.
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