제안 방법

• 동일한 방법으로 세척한 후 8~16 units] 항원을 각 well에 100 μl씩 분주하여 상기와 동일한 방법으로 반응시킨 후 세척하고 1:1000으로 희석된 hamster anti-Hantaan serum-l- 각 well에 100 씩 분주하여 반응시킨 후 세척하였다. 1:1000으로 희석한 peroxidase-conju-gated anti-hamster IgG (KPL, USA)을 100 pl씩 분주하여 반응시킨 후 세척하였고 기질용액 (KPL, USA) 100 μl을 가하여 36.5℃에서 30분 간 반응한 후 ELISA 광량계 (MCC/340, Finland)로 405 nm 광 파장에서 O.D. 값을 측정 하였다.
• 1차 증폭된 DNA를 혈청형 특이 primer를 이용하여 nested RT-PCR을 하였다. Hantaan virus prim­er (HTN GIF, HTN G1R) 및 Seoul virus primer(SEO GIF, SEO G1R)를 혈청형 특이 primer를 포함하는 nested RT-PCR mixture 48 μ1을 1차 PCR 2 μl와 첨가하여 Gene cyclerTM를 이용하여 30회의 thermal cycling step으로 증폭시켰다.
• 2)로 3회 세척하고, 증류수로 1회 씻은 다음 실온에서 건조시켰다. 2차 반응은 FITC goat anti-human IgG (KPL, USA)를 8~16 unit로 적정 하여 20 ㎕씩 가한 후 1차 반응과 동일한 방법으로 반응시킨 후 세척과 건조하여 mounting media 를 가하고 유리덮개를 덮어 형광현미경 (Zeiss, Germany)으로 특이 형광반응을 관찰 (X400) 하였다.
• DEPC-treated H20에 용해되어 있는 2가지 바이러 스의 RNA 10 ℃에 1 μ1 (1 pmole)의 primer MOF103 (Table 1)을 0.2 ml thin wall microtube에 첨가하여, 10분 간 70℃에서 가열하여 불활화시킨 다음 40℃ 로 식혀 바이러스의 RNA와 primer를 annealing시 킨 다음 RNase inhibitor, 5 × reverse transcriptase buffer, 2 mM dNTPs mixture, 0.1 M DTT, 10 unit MMLV reverse transcriptase, cDNA synthesis buffer를 첨가한 후 Gene cycleTM (Bio­ Rad, Japan)를 이용하여 40℃에서 90분 간 그리고 95℃ 에서 5분 간 가열하여 총 20 μl의 한타바이러스 cDNA를 합성하였고 연속적으로 PCR을 실시하였다.
• Ethidium bromide를 포함하는 TAE buffer를 이용한 1.2% agarose gel에서 10 x loading buffer 1 μ1와 증폭된 DNA 9 μ1을 30분 간 100 volt에서 전기영동하여, UV transillu-minator (Model SL-20 DNA Image Visualizer, USA)를 이용하여 Polaroid 사진을 찍었고, DNA size market로는 100 bp DNA size ladder (GibcoBRL)를 사용하였다 (Fig. 1, 2).
• nested RT-PCR을 하였다. Hantaan virus prim­er (HTN GIF, HTN G1R) 및 Seoul virus primer(SEO GIF, SEO G1R)를 혈청형 특이 primer를 포함하는 nested RT-PCR mixture 48 μ1을 1차 PCR 2 μl와 첨가하여 Gene cyclerTM를 이용하여 30회의 thermal cycling step으로 증폭시켰다. Melting stepe 94p 에서 30초, annealing stepe 50℃에서 30초, 그리고 extention step IFAT로 한탄바이러스의 항체를 검사하기 위해 한탄과 서울바이러스 감염 Vero E6 (African green monkey kidney, ATCC-CRL 1586) 세포를 12~18시간 배양한 spot slide를 냉각 아세톤으로 10분 간 고정한 후 공기 중에서 건조시킨 다음 1차 반응은 각 well에 환자 혈청을 20 ㎕씩 가한 후 moist chamber에 넣어 36.5℃ 에서 30분 간 반응시켰다. 반응시킨 slide를 냉각된 인산완충식염수 (PBS; 0.
• RT-PCR 은 10 μ1의 cDNA 에 총 40 μ1의 RT-PCR mixture를 첨가하여 실시하였다. RT-PCRe Gene * cycler™ 를 이용하여 30회의 thermal cycling step으로 증폭시 켰다.
• V형 96-well microplate (A&T Co, Tokyo)에 검사대상 혈청을 1:20으로 희석하여 처음 두 well에서 각각 25 μl씩 분주하고 3번째 well부터 최종 well까지 계단 희석을 하였다. 한탄바이러스 항원으로 감작시키지 않은 대조 HDP액 25 μl씩을 처음 well에 각각 분주하고 한탄바이러스 항원감작 HDP액을 2번 well부터 최 종 well까지 25 μl씩 분주한 후 microplate를 microplate mixer를 사용하여 약 10초 간 교반한 후 60분 간 실온에 정치한 후 결과를 판독하였다.
• 2)로 1:1000으로 희석하여 100 ㎕을 96-well polyvinyl U plate (Dynatech LAB, USA)의 각 well에 넣어 도포한 후 4℃에서 12-24시 간 동안 놓아 두었다. 그 후 0.1% Tween 20을 첨가한 인산완충식염수로 3회 세척한 후 환자 혈청을 5% skim milk로 1:100부터 계단 희석하여 상기 well에 100 μl씩 분주하고 36.5℃에서 45~60분 간 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척하여 1:1000 으로 희석된 peroxidase-conjugated anti-human IgG (KPL, USA)을 100 μl씩 분주하여 반응시킨 후 세척 하였고 기질용액 (KPL, USA) 100 μ1을 가하여 36.
• 5℃에서 45~60분 간 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척하여 1:1000 으로 희석된 peroxidase-conjugated anti-human IgG (KPL, USA)을 100 μl씩 분주하여 반응시킨 후 세척 하였고 기질용액 (KPL, USA) 100 μ1을 가하여 36.5℃에서 30분간 반응한 후 EUSA 광량계 (MCC/ 340, Finland)로 405 nm 광파장에서 O.D. 값을 측정하였다.
• 본 연구에서는 원인불명열 (fever unknown ori­gin, FUO)로 내원한 환자에서 채혈하여 분리한 혈청을 한탄바이러스에 대한 IFAT, ELISA (IgG, IgM), HDPA 그리고 PRNT 등의 검사를 시행하여 결과를 비교하였으며, 신증후출혈열로 확진된 환자에서는 PRNT와 혈청형 특이 역전사 효소 중합 효소 연쇄반응 (nested reverse transcriptase polyme­ rase chain reaction, nested RT-PCR)을 이용하여 한타바이러스 혈청형을 조사하였다.
• 중화항체의 존재와 그 역가를 측정 하기 위하여 PRNT를 실시하였고, 환자 혈청의 최초 희석배수는 1:10이었으며 다음 2배 계단 희석하여 최종 플라크감소 중화시험을 실시하였다. 희석된 검체 100 μ1에 200 plaque forming unit (PFU)의 한탄과서울바이러스를 각각 동량 혼합한 후 4℃ 냉장고에서 16시간 환자 혈청을 이용하여 중화시킨 다음, 미리 준비한 6-well plate (Linbro™, USA)에서 단층 배양한 Vero E6 세포에 시료를 100 ㎕씩을접종하여 36.
• 계단 희석을 하였다. 한탄바이러스 항원으로 감작시키지 않은 대조 HDP액 25 μl씩을 처음 well에 각각 분주하고 한탄바이러스 항원감작 HDP액을 2번 well부터 최 종 well까지 25 μl씩 분주한 후 microplate를 microplate mixer를 사용하여 약 10초 간 교반한 후 60분 간 실온에 정치한 후 결과를 판독하였다.
• 혼합액을 흡착 후 1차 한천 중첩배지를 2 ml 첨 가하여 굳힌 다음 36.5℃, 5% CO₂ 배양기 에서 7일 간 배양하고, 5% neutral red를 함유한 2차 한천 중첩배지를 1 ml 첨가한 후 2~3일에 걸쳐 나타나는 한탄바이러스의 플라크의 수를 계산하여 중화항체가를 결정 하였다. 중화항체가는 바이러스 플라크를 50% 이상 감소시키는 혈청 희석배수의 역수로써 표시하였다.