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문제 정의
- 1997).본 논문에서는 높은 스트레스 조건에서 배양되는 24종의 캘러스의 GSH 함량과 아울러 황금 {Scutellaria baicalensis) 현탁배양에 따른 glutathione 함량 변화를 환원형인 GSH와 산화형인 GSSG로 나누어 조사하 였다
제안 방법
- 5)] 3mL이 첨가된 1회용 큐벳에 시료 100 此와 611 10 unit (10 pL)를 넣고 혼합하여 412nm에서 1분간 반응시켜 흡광도 변화를 조사하여 GSH 표준 검량선으로부터 구하였다. 산화형 GSSG의 함량은 시료에 5 pL 4-vinylpyridine (95% 순도)을 첨가하여 1。분 동안 상온에서 반응시킨 후, 상기 반응액 3 mL과 혼합하여 전체 glutathione 함량분석과 같은 방법으로 측정하였다. GSH의 함량은 전체 glutathione 함량과 GSSG 함량의 차로서 산출하였다 실험에 사용한 시약은 Sigma사로 부터 구입하였다
- 생명공학연구소 식물연구팀과 유전자원센터 유전자은행실에 의해 관리, 배양되고 있는 캘러스 24종을 대상으로 환원형 GSH와 산화형 GSSG의 함량을 조사하였다. 모든 세포주는 4주 간격으로 계대 배양하여 25℃에서 암배양하였다.
- 황금 (Scutellaria baicalensis) 현탁배양세포는 Ahn 등(1999)이 확립한 현탁배양세포주를 사용하였다. 생중량 1 g의 세포를 2 mg/L p-chlorophenoxyacetic acid (p-CPA), 0.5 mg/L 2, 4-D, 0.1 mg/L kinetin과 30 g/L sucrose가 함유된 SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) 50 mL 배지를 함유한 250 mL 플라스크에서 접종하여 25℃에서 암조건에서 진탕배 양(lOOrpm) 하였다.
- 식물배양세포의 항산화기구를 이해하기 위하여 다양한 유도조건에서 확립된 24종의 세포주를 대상으로 환원형(GSH) 과 산화형(GSSG)의 glutathione 함량을 조사하였다. 배양세포의 전체 glutathione 함량 (pg/g cell fresh wt)은 98 ±27로 식물종에 따라 큰 차이가 없었다.
- 5 mL과 혼합하여 glutathione 함량분석 시료로 사용하였다. 전체 glutathione 함량은 반응액[5 mM EDTA, 0.6 mM 5, 5, -dithiobis- (2-nitrobenzoic acid), 0.2 mM NADPH를 포함하는 100 mM 인산 완충액 (pH 7.5)] 3mL이 첨가된 1회용 큐벳에 시료 100 此와 611 10 unit (10 pL)를 넣고 혼합하여 412nm에서 1분간 반응시켜 흡광도 변화를 조사하여 GSH 표준 검량선으로부터 구하였다. 산화형 GSSG의 함량은 시료에 5 pL 4-vinylpyridine (95% 순도)을 첨가하여 1。분 동안 상온에서 반응시킨 후, 상기 반응액 3 mL과 혼합하여 전체 glutathione 함량분석과 같은 방법으로 측정하였다.
대상 데이터
- 산화형 GSSG의 함량은 시료에 5 pL 4-vinylpyridine (95% 순도)을 첨가하여 1。분 동안 상온에서 반응시킨 후, 상기 반응액 3 mL과 혼합하여 전체 glutathione 함량분석과 같은 방법으로 측정하였다. GSH의 함량은 전체 glutathione 함량과 GSSG 함량의 차로서 산출하였다 실험에 사용한 시약은 Sigma사로 부터 구입하였다
- 황금 (Scutellaria baicalensis) 현탁배양세포는 Ahn 등(1999)이 확립한 현탁배양세포주를 사용하였다. 생중량 1 g의 세포를 2 mg/L p-chlorophenoxyacetic acid (p-CPA), 0.
이론/모형
- Glutathione 함량은 glutathione reductase (GR)과 4- vinylpyridine를 이용한 Griffith (1980)의 방법에 따라 측정하였다. 대수증식 후기에 해당하는 캘러스 또는 황금현탁배 양 후 일정 간격으로 수확한 세포생체중().
성능/효과
- 식물세포는 GSH의 항산화 및 환원제로서의 역할을 수행하기 위하여 높은 GSH/GSSG 의 비율을 유지할 필요가 있는 것으로 생각된다. 배양세포의 glutathione 함량은 몇 종의 식물체 잎의 함량과 비교한 결과, 식물체 잎보다 약 2~3배 높음이 확인되었다 (결과 미제시).식물배양세포의 세포 내 기관별 그리고 세포생장 단계별 glutathione 함량을 조사하면 각 기관별, 배양시 기 별 배양세포의 항산화기구를 이해하는데 도움이 될 것으로 생각되며 향후 이에 대한 자세한 실험을 수행할 예정이다.
- 배양세포의 환원형 GSH과 산화형 GSSG 의 평균 함량 (pg/g fr wt)은 각각 72±20와 26 ±10을 나타내었다. 배양세포의 전체 glutathione 중에서 평균 환원형 GSH는 약 73%를 차지하였다. 황금 (Scutellaria baicalensis、) 배양세포의 현탁배양에 따른 GSH 함량 (pg/g cell fresh wt)은 계대 배양부터 대수증식기까지는 계속 하여 감소하여 세포생장 정지기인 배양 후 13일에는 84까지 감소한 후 다시 증가하였다가 배양 후기에는 크게 감소하였다.
- 조사한 배양세포의 전체 glutathione 함량(환원형 GSH와 산화형 GSSG의 합한 함량)은 98±27 (pg/g cell fresh wt)로 식물 종류에 따른 함량 변화는 크지 않았다. 배양세포의 환원형 GSH과 산화형 GSSG의 평균함량 (pg/g cell fresh wt)은 각각 72土20와 26土10으로 환원형인 GSH가 산화형인 GSSG의 함량보다 약 2.8배 높아 배양세포의 전체 잉utathione중에서 환원형 GSH는 약 73%를 차지하였다. 조사한 배양세포 중에서 전체 glutathione함량은 하수오 (Pleuropterus multiflorus)와 월계화 (Rosa에서 각각 175.
- 세포생장 초기 단계의 캘러스생장이 왕성한 대수증식기의 캘러스 그리고 노화가 진전된 캘러스로 구분하여 glutathione 함량을 분석한 결과, 전체 glutathione 함량 가운데 산화형 GSSG의 함량 비율이 각각 33%, 59%, 62%를 나타내어 배양 후기에 갈수록 산화형의 비율이 증가하였다. 세포생장에 따른 전체 glutathione 함량 변화와 환원형 GSH와 산화형 GSSG 의 비율 변화는 glutathione이 세포 생장 및 배양세포의 항산화기구에 중요하게 관여하고 있음을 시사하는 것으로 추후 자세한 연구가 요구된다.
- 8배 높아 배양세포의 전체 잉utathione중에서 환원형 GSH는 약 73%를 차지하였다. 조사한 배양세포 중에서 전체 glutathione함량은 하수오 (Pleuropterus multiflorus)와 월계화 (Rosa에서 각각 175.5와 140.6으로 평균값의 각각 약 1.8배와 1.4배 높았다. 그리고 당느릅나무 (Uhnus da\、idiana) 세포주가가장 낮은 값(48.
- 다양한 식물종에서 유도한 배양세포주 24종의 환원형(GSH)와 산화형(GSSG) glutathione 함량을 Table 1에 정리하였다. 조사한 배양세포의 전체 glutathione 함량(환원형 GSH와 산화형 GSSG의 합한 함량)은 98±27 (pg/g cell fresh wt)로 식물 종류에 따른 함량 변화는 크지 않았다. 배양세포의 환원형 GSH과 산화형 GSSG의 평균함량 (pg/g cell fresh wt)은 각각 72土20와 26土10으로 환원형인 GSH가 산화형인 GSSG의 함량보다 약 2.
- 황금 배양세포의 현탁배양에 따른 GSH의 함량 (|jg/g cell fresh wt)은 계대배양후 1 일부터 세포생장 정지기에 해당하는 13일까지는 약 84까지 계속적으로 감소한 후 배양 후 19일에는 다시 178까지 증가하였다가 배양 후기에 해당하는 25일에는 22로 크게 감소하였다 (Figure 1). 한편 GSSG의 함량 (pg/g cell fresh wt)은 흥미롭게도 대수증식기간에는 증가하여 배양 후 13일에는 31까지 증가하였고 배양 후기인 25일에는 약 48까지 증가하였다 세포생장 초기에는 전체 glutathione 중에서 환원형 GSH의 비율이 98.5%로 대부분을 차지하였으나, 세포생장 정지기에 해당하는 배양 13일과 배양 후기에 해당하는 25일에는 각각 73.0%와 31.4%를 차지하였다. 특히 노화가 진전된 25일째 세포에서는 오히려 산화형 GSSG의 비율이 높았다.
- 배양세포의 전체 glutathione 중에서 평균 환원형 GSH는 약 73%를 차지하였다. 황금 (Scutellaria baicalensis、) 배양세포의 현탁배양에 따른 GSH 함량 (pg/g cell fresh wt)은 계대 배양부터 대수증식기까지는 계속 하여 감소하여 세포생장 정지기인 배양 후 13일에는 84까지 감소한 후 다시 증가하였다가 배양 후기에는 크게 감소하였다. 한편 GSSG의 함량 (pg/g cell fresh wt)은 오히려 대수증식기까지는 증가하여 배양 후 13일에는 31을 나타내었고 배양 후기인 25일에는 48로 오히려 산화형 GSSG의 비율이 높았다.
후속연구
- Glutathione은 AsA와 함께 식물의 대표적인 항산화기구의 구성 성분이기 때문에 황금배양세포에서 얻어진 결과가 모든 식물배양 세포의 특성을 반영하는 것인지 황금식물의 특징적인 것인지를 알아보기 위해서는 다른 식물종의 배양세포를 사용하여 동일한 실험을 수행할 필요가 있다 (Noctor 1998). 또한 배양세포에서의 glutathione과 AsA의 역할을 규명하기 위해서는 배양세포에 인위적인 외부 환경 스트레스를 처리하였을 때 이들의 전체 함량 및 환원형과 산화형의 조성 변화를 조사할 필요가 있으며 현재 이에 관한 실험이 진행 중이다.
- 세포생장 초기 단계의 캘러스생장이 왕성한 대수증식기의 캘러스 그리고 노화가 진전된 캘러스로 구분하여 glutathione 함량을 분석한 결과, 전체 glutathione 함량 가운데 산화형 GSSG의 함량 비율이 각각 33%, 59%, 62%를 나타내어 배양 후기에 갈수록 산화형의 비율이 증가하였다. 세포생장에 따른 전체 glutathione 함량 변화와 환원형 GSH와 산화형 GSSG 의 비율 변화는 glutathione이 세포 생장 및 배양세포의 항산화기구에 중요하게 관여하고 있음을 시사하는 것으로 추후 자세한 연구가 요구된다.
- 배양세포의 glutathione 함량은 몇 종의 식물체 잎의 함량과 비교한 결과, 식물체 잎보다 약 2~3배 높음이 확인되었다 (결과 미제시).식물배양세포의 세포 내 기관별 그리고 세포생장 단계별 glutathione 함량을 조사하면 각 기관별, 배양시 기 별 배양세포의 항산화기구를 이해하는데 도움이 될 것으로 생각되며 향후 이에 대한 자세한 실험을 수행할 예정이다.
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