원형질체는 현탁배양된 세포괴로부터 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23, 그리고 0.5% driselase가 포함된 CPD 효소용액에서 4시간의 진탕 (40 rpm)조건에서 쉽게 분리되었다. 분리된 원형질체는 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetin , 200 rng/L spermidine 그리고 68 g/L glucose가 포함된 KM 액체배지에서 배양되었으며, 또한 현탁배양중인 동종의 feeder cell이 있는 CP배지 위에 액체배양배지를 1 mL균일하게 퍼트린 후,$25^{\circ}C$, 암조건으로 4주간 양육배양하였다. 원형질체 유래 SF 캘러스는 0.05 mg/L IAA, 7 mg/L 2lip와 30mg/L sucrose가 첨가된 MS 재분화 배지에서 광조건으로 4주동안 배양되었을 때, 60% 이상의 shoot를 형성하였다. 이후, 식물의생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였으며, 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 배양 8주후에 종자를 형성하였다.
원형질체는 현탁배양된 세포괴로부터 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23, 그리고 0.5% driselase가 포함된 CPD 효소용액에서 4시간의 진탕 (40 rpm)조건에서 쉽게 분리되었다. 분리된 원형질체는 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetin , 200 rng/L spermidine 그리고 68 g/L glucose가 포함된 KM 액체배지에서 배양되었으며, 또한 현탁배양중인 동종의 feeder cell이 있는 CP배지 위에 액체배양배지를 1 mL균일하게 퍼트린 후,$25^{\circ}C$, 암조건으로 4주간 양육배양하였다. 원형질체 유래 SF 캘러스는 0.05 mg/L IAA, 7 mg/L 2lip와 30mg/L sucrose가 첨가된 MS 재분화 배지에서 광조건으로 4주동안 배양되었을 때, 60% 이상의 shoot를 형성하였다. 이후, 식물의생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였으며, 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 배양 8주후에 종자를 형성하였다.
Protoplasts of Arabidopsis thaliana were easily isolated from the shoot-forming (SF) suspension-cultured cell clusters with 4 hours-shaking condition (40 rpm) on CPD enzyme solution containing 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23 and 0.5% driselase. Protoplasts were cultured on liquid KAO medium...
Protoplasts of Arabidopsis thaliana were easily isolated from the shoot-forming (SF) suspension-cultured cell clusters with 4 hours-shaking condition (40 rpm) on CPD enzyme solution containing 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23 and 0.5% driselase. Protoplasts were cultured on liquid KAO medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetin, 200 mg/L spermidine and 68 g/L glucose. Also, protoplasts were cultured on 0.2 $\mu$M membrane filter placed onto CP solid medium containing the suspension cells as feeder cells in the dark at $25^{\circ}C$ for 4 weeks. Protoplast-derived-SF calli were cultured on MS medium containing 0.05 mg/L IAA, 7 mg/L 2 ip and 30 g/L sucrose under the continuous illumination for four weeks. The frequency of shoot formation was about 60%. The regenerants were transferred into potting soil to grow mature plants. The regenerants formed the silques with seeds after 8 weeks of cultures.
Protoplasts of Arabidopsis thaliana were easily isolated from the shoot-forming (SF) suspension-cultured cell clusters with 4 hours-shaking condition (40 rpm) on CPD enzyme solution containing 1% cellulase R-10, 0.25% pectolyase Y-23 and 0.5% driselase. Protoplasts were cultured on liquid KAO medium supplemented with 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetin, 200 mg/L spermidine and 68 g/L glucose. Also, protoplasts were cultured on 0.2 $\mu$M membrane filter placed onto CP solid medium containing the suspension cells as feeder cells in the dark at $25^{\circ}C$ for 4 weeks. Protoplast-derived-SF calli were cultured on MS medium containing 0.05 mg/L IAA, 7 mg/L 2 ip and 30 g/L sucrose under the continuous illumination for four weeks. The frequency of shoot formation was about 60%. The regenerants were transferred into potting soil to grow mature plants. The regenerants formed the silques with seeds after 8 weeks of cultures.
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문제 정의
(Pattom and Meinke 1988; Chaudhury and Signer 1989). 본 연구에서는 애기장대의 현탁배양세포의 원형질체로부터 기관분 화와 발달을 이루기 위해서 원형질체 분리율을 높이고 동시에 생존력을 지속시킬 수 있는 최적조건을 구명하는 배양방법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
일반적으로 배발생 컬러스는 희고 단단하며 부서지기 쉬운 상태라고 보고되었는더 iTorello et al, 1984), 본 실험에서도 유도된 캘러스에서 고%이 매끈하고 잘 떨어지는 옅은 노란색을 띠는 shoot farming (SF) 캘러스를 형태적으로 선별하여 동일배지에 계 다비앙하였으며, 계대배양 4주 후에는 부피가 3~4배로 증가 하였다 (Figure 1A). 2회 이상 계대배양한 캘러스로부터 SF캘리스를 육안으로 선별하여 현탁배양의 재료로 사용하였으며 처읔 2개월간은 3~4일 간격으로, 이후로는 7일 간격으로 #디배양하였으며 27℃ 암소에서 lOOrpm으로 진탕배양하였 배양 2개월 후부터 단일세포로 분리 (Figure IB)가 되었으며 초기에 관찰되었던 세포질이 텅빈 세포들은 시간이 경과됨에 따라 제거되고 배양 4개월 후에는 10~50개 세포로 그섭된 균질화된 옅은 노란색의 SF 캘러스 (Figure 1C)를 확 H 할 수 있었다. 이들 세포괴는 세포질이 매우 충만한 모습이 있고 생존력이 높아 원형질체의 재료로 적합하였다.
액체배양 4개월 후에 형성된 균일한 cell linee 새로운 배지를 첨가한 3일째 되는 세포(2 mL)를 수거해 새로운 배지에 첨가하여 배양을 시작하였으며 배양 시작일부터 14일까지 2일 간격으로 세포를 회수해 packed cell volume (PCV) 및 dry weight (DW)를 측정하였다. PCV 측정은 현탁배양액을 눈금이 새겨진 15 mL 원심분리관에 옮기고 200 X g에서 5분간 원심분리 후 밑에 침적된 침전물의 부피를 측정하였으며, 세포 건중량은 여과지(Whatman #2, 0 90 mm)에 세포를 회수한 후 60℃, 12시간 건조시킨 다음 측정하였다.
dFor each experiment, 10 calli were tested with five different cultures, and the frequencies were measured by counting the number of calli regenerating more than one shoot per 50 calli.
) Heynh. ecotype Columbia)의 종자를 4% NaOCl가 포함된 유한락스를 5%로 희석하여 20분동안 가볍게 흔들어 주면서 표면을 소독한 뒤, 멸균증류수로 5회 세척하였다. 세척한 종자를 1% sucrose가 포함된 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 무균발아시켜 4~5주 동안 성장한 총생형 식물체의 줄기 절편체를 재료로 사용하여 0.
기내에서 4~5주 동안 성장한 애기장대 (Arabidopsis th.iliana) 식물체의 잎과 줄기 절편체를 CP 기본배지에 0.5 mj/L 2, 4-D와 0.1 mg/L BAP가 첨가된 배지에서 암조건으로 4.주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 일반적으로 배발생 컬러스는 희고 단단하며 부서지기 쉬운 상태라고 보고되었는더 iTorello et al, 1984), 본 실험에서도 유도된 캘러스에서 고%이 매끈하고 잘 떨어지는 옅은 노란색을 띠는 shoot farming (SF) 캘러스를 형태적으로 선별하여 동일배지에 계 다비앙하였으며, 계대배양 4주 후에는 부피가 3~4배로 증가 하였다 (Figure 1A).
이들 세포괴는 세포질이 매우 충만한 모습이 있고 생존력이 높아 원형질체의 재료로 적합하였다. 또한 현탁배양에서 세포의 증식측정은 PCV (packed cell volume)로 하였으며, 생물량은 현탁배양 2일째까지는 세포분열이 거의 업었으며, 이후 활발한 세포분열이 일어나 10일 후에는 PCV가 접종시의 4배가 되어 전형적인 sigmoid 곡선을 나타 났으며 (Figure 2), 계대배양은 PCV가 3배 이상이 된 8일 후 T 하였다. 이와 같이 생존력이 높은 SF 현탁배양 세포를 유지 하기 위해 계대배양과정에서 규칙적으로 배지를 교환해 주는 것과 2 주 간격으로 커다란 세포괴를 제거해 주는 것이 필수 적이었다.
2회 세척한 원형질체는 CPW 21S의 상층부에 넣고 10분간 800 rpm으로 비중차 원심분리하여 상층부의 건전한 원형질체를 5 X10, cells/mL의 밀도가 되도록 희석한 후, 액체배양과 양육배양하였다. 배양배지로는 MS 배지에 2 mg/L NAA와 0.5 mg/L BAP가 첨가된 MSNB배지, 2 mg/L IAA, 0.5 mg/L 2, 4-D와 0.5 mg/L 2ip가 첨가된 MSIDP배지 그리고 KM (Kao and Michayluk 1975)배지에 1 mg/L 2, 4-D, 0.15 mg/L kinetin과 200 mg/L spermidine이 첨가된 KMDKS배지에 삼투조절제로 9% mannitol이 포함된 액체 배지를 사용하였다. 양육 배양은 현탁배양중인 동종의 feeder cell (Krans et al.
5% driselase가 포함된 CPD 효소용액에서 4시간의 진탕 (40 rpm) 조건에서 쉽게 분리 되었다. 분리된 원형질체는 1 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L kinetir, 200 mg/L spermidine 그리고 68 g/L glucose가 포함된 KM 엑체배지에서 배양되었으며, 또한 현탁배양중인 동종의 feMercell이 있는 CP배지 위에 액체배양지를 1mL 균일하게 퍼트린 후, 25℃, 암조건으로 4주간 양육배양하였다. 원 # 유래 SF 캘러스는 0.
원형질체 배양에서 원형질체의 세포벽 재생과 세 포분열은 배지내 접종된 세포의 수와 첨가된 식물생장조절물 질에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며 (Mayer and Cooke 1979), 애기장대의 최적의 접종 세포수의 범위는 4x ~5 xl#개로서 그 이하의 밀도나 그 이상의 밀도에서는 지속적인 세포분열을 관찰할 수 없었다. 분리된 원형질체의 배양은 MS 배지에 2 mg/L NAA와 0.5 mg/L BAP가 첨가된 MSNB, MS 배지에 2 mg/L IAA, 0.5 mg/L 2, 4-D 및 0.5 mg/L 2ip가 첨가된 MSIDP, KM배지에 1 mg/L 2, 4-D, 0.15 mg/L kinetin 과 200 mg/L spermidine 이 첨가된 KMDKS배지에서 각각 액체배양하였으며, 또한 현탁배양중인 동종의 feeder cell이 있는 CP 배지 위에 0.2 μ membrane filter를 얹고 현탁배양액 1 mL를 균일하게 접종하는 양육배양을 병 행하였다.
ecotype Columbia)의 종자를 4% NaOCl가 포함된 유한락스를 5%로 희석하여 20분동안 가볍게 흔들어 주면서 표면을 소독한 뒤, 멸균증류수로 5회 세척하였다. 세척한 종자를 1% sucrose가 포함된 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 무균발아시켜 4~5주 동안 성장한 총생형 식물체의 줄기 절편체를 재료로 사용하여 0.5 mg/L 2, 4-D와 0.1 mg/L BAP가 첨가된 CP (CLC/Ipomoea basal medium, Duchefa cat. no. CO228)배지에서 캘러스를 유도하였다. 캘러스 중에서 세포들이 매우 치밀하게 배열되어 있으며 그 표면에 광택이 있으면서 우유 빛을 띠고 전반적으로 둥근모습을 나타내는 shoot-forming (SF) 캘러스를 선별하여 동일 배지로 계대배양하였다.
처음 2개월은 3~4일간격으로, 이후로는 7일 간격으로 계대배양 하였으며 커다란 세포괴를 제거하기 위해서 860 M 스테인레스체로 배양세포를 여과시켰다. 액체배양 4개월 후에 형성된 균일한 cell linee 새로운 배지를 첨가한 3일째 되는 세포(2 mL)를 수거해 새로운 배지에 첨가하여 배양을 시작하였으며 배양 시작일부터 14일까지 2일 간격으로 세포를 회수해 packed cell volume (PCV) 및 dry weight (DW)를 측정하였다. PCV 측정은 현탁배양액을 눈금이 새겨진 15 mL 원심분리관에 옮기고 200 X g에서 5분간 원심분리 후 밑에 침적된 침전물의 부피를 측정하였으며, 세포 건중량은 여과지(Whatman #2, 0 90 mm)에 세포를 회수한 후 60℃, 12시간 건조시킨 다음 측정하였다.
액체배양과 양육배양을 통해 microcolony가 형성되면 캘러스 증식배지로 옮겨 5 mm 이상 캘러스 크기로 생장을 유도한 다음, MS 기본배지에 0.05 mg/L IAA와 7 mg/L 2ip가 첨가된 재분화 배지로 옮겨 처음 2주 동안은 2TC, 16시간 광조건과 8시간 암조건에서 배양한 다음에 연속 광조건으로 옮겨 shoot 분화를 유도하였다. 분화된 shoot는 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지로 옮겨 root를 유도하였으며 순화과정을 거친 후에 토양으로 이식하여 완전한 식물체로 생장시켰다.
15 mg/L kinetin과 200 mg/L spermidine이 첨가된 KMDKS배지에 삼투조절제로 9% mannitol이 포함된 액체 배지를 사용하였다. 양육 배양은 현탁배양중인 동종의 feeder cell (Krans et al. 1991)이 있는 CP배지 위에 0.2 g mem- brane filter를 얹고 액체배양액 1 mL를 균일하게 퍼트린 다음에 암조건과 광조건에서 배양하여 세포분열을 유도하였으며, 생존율은 배양배지에서 하루 경과된 세포를 fluorescein diacetate (FDA)를 이용하여 측정하였다. 양육배양 2주 후에는 원형질체가 치상된 membrane filter# 새로운 feeder cell이 있는 CP 배지 위로 옮겨 배양하였으며, 원형질체의 분열 정도를 살펴가며 mannitol의 농도를 3%씩 낮춘 동일한 액체 배지를 첨가하여 microcolony 생성을 유도하였다.
2 g mem- brane filter를 얹고 액체배양액 1 mL를 균일하게 퍼트린 다음에 암조건과 광조건에서 배양하여 세포분열을 유도하였으며, 생존율은 배양배지에서 하루 경과된 세포를 fluorescein diacetate (FDA)를 이용하여 측정하였다. 양육배양 2주 후에는 원형질체가 치상된 membrane filter# 새로운 feeder cell이 있는 CP 배지 위로 옮겨 배양하였으며, 원형질체의 분열 정도를 살펴가며 mannitol의 농도를 3%씩 낮춘 동일한 액체 배지를 첨가하여 microcolony 생성을 유도하였다. 캘러스 크기가 0.
양육배양에서는 배양 2주 후에 원형질체가 치상된 membrane filter를 새로운 feeder cell이 있는 동일배지로 계 대배양하였으며, 원형질체 분열 정도를 살펴가며 mannitol의 농도를 3%씩 낮춘 동일배지를 첨가하였다. Plating efficiency (Figure 6)는 액체배양에서보다 feeder cell이 첨가된 고체배지에서 배양하였을 때 30일 이후에 육안으로 볼 수 있는 36개 (0.
8로 적정한 CPW 13M을 첨가 하여 27℃, 암조건에서 3~10시간 동안 정체배양 및 진탕배 양(40rpm)을 통해 원형질체를 분리하였다. 원형질체를 정제하기 위하여 효소혼합액을 230, 190, 74 그리고 45 g cell dissociation sieve에 통과시켜 5분간 800 rpm으로 원심분리 하였다. 2회 세척한 원형질체는 CPW 21S의 상층부에 넣고 10분간 800 rpm으로 비중차 원심분리하여 상층부의 건전한 원형질체를 5 X10, cells/mL의 밀도가 되도록 희석한 후, 액체배양과 양육배양하였다.
1973) 13M 용액을 첨가하여 4℃, 암소에 방치하여 전처리하였다. 전처리를 한 후에 CPW 13M 용액을 제거한 다음 0.2 |j membrane filter로 멸균한 CPD (1% Cellulase R-10, 0.25% Pectolyase Y-23과 0.5% Driselase)와 CM2 (1% Cellulase R-10과 0.25% Mace- rozyme R-10) 효소액에 pH 5.8로 적정한 CPW 13M을 첨가 하여 27℃, 암조건에서 3~10시간 동안 정체배양 및 진탕배 양(40rpm)을 통해 원형질체를 분리하였다. 원형질체를 정제하기 위하여 효소혼합액을 230, 190, 74 그리고 45 g cell dissociation sieve에 통과시켜 5분간 800 rpm으로 원심분리 하였다.
5—1 g 정도를 250 mL Erlenmeyer flask에 50 mL의 CP 액체배지를 첨가하여 25℃ 암소에서 100rpm으로 현탁배양 하였다. 처음 2개월은 3~4일간격으로, 이후로는 7일 간격으로 계대배양 하였으며 커다란 세포괴를 제거하기 위해서 860 M 스테인레스체로 배양세포를 여과시켰다. 액체배양 4개월 후에 형성된 균일한 cell linee 새로운 배지를 첨가한 3일째 되는 세포(2 mL)를 수거해 새로운 배지에 첨가하여 배양을 시작하였으며 배양 시작일부터 14일까지 2일 간격으로 세포를 회수해 packed cell volume (PCV) 및 dry weight (DW)를 측정하였다.
CO228)배지에서 캘러스를 유도하였다. 캘러스 중에서 세포들이 매우 치밀하게 배열되어 있으며 그 표면에 광택이 있으면서 우유 빛을 띠고 전반적으로 둥근모습을 나타내는 shoot-forming (SF) 캘러스를 선별하여 동일 배지로 계대배양하였다.
성능/효과
1992). CPW 13 M 용액을 제거한 다음 0.2 μ membrane filter로 멸 균한 효소용액 CPD (1% cellulase R-10, 0.25% pecto lyase Y-23과 0.5% driselase)와 CM2 (1% cellulase R-10과 0.25% macerozyme R-10)를 넣고 암조건에서 8시간 동안 정 체배양과 4시간 동안 진탕배양 (40rpm)을 통해 분리한 결과 (Figure 3), CPD 용액에서 4시간 동안 진탕배양시 생체량 1 g 당 106~107개의 건전한 원형질체를 얻을 수 있었으며, wassilewskija의 현탁배양 cell line (Ford 1990)과 비교시 높은 분리율을 보여주었다. 또한, 분리된 원형질체의 생존율도 40%인 wassilewskija에 비해 80% (2 x 107 cells/g) 이상으로 높은 생존율을 얻을 수 있었는데 (Figure 4), wassilewskija의 경우는 2년 동안의 현탁배양 기간이 길어짐에 따라 세포의 활성이 떨어지는데 비해 4개월 동안 현탁배양한 cell line 은 세포질이 충만하여 생존력이 높은 원형질체를 얻을 수 있었기 때문으로 사료된다.
25% macerozyme R-10)를 넣고 암조건에서 8시간 동안 정 체배양과 4시간 동안 진탕배양 (40rpm)을 통해 분리한 결과 (Figure 3), CPD 용액에서 4시간 동안 진탕배양시 생체량 1 g 당 106~107개의 건전한 원형질체를 얻을 수 있었으며, wassilewskija의 현탁배양 cell line (Ford 1990)과 비교시 높은 분리율을 보여주었다. 또한, 분리된 원형질체의 생존율도 40%인 wassilewskija에 비해 80% (2 x 107 cells/g) 이상으로 높은 생존율을 얻을 수 있었는데 (Figure 4), wassilewskija의 경우는 2년 동안의 현탁배양 기간이 길어짐에 따라 세포의 활성이 떨어지는데 비해 4개월 동안 현탁배양한 cell line 은 세포질이 충만하여 생존력이 높은 원형질체를 얻을 수 있었기 때문으로 사료된다.
원형질체 배양액인 KMDKS는 polyaminespermidine을 첨가함으로써 원형질체의 분열능력과 생존력을 향상시켰기 때문에 MSNB와 MSIDP에 비해 배양이 진행되면서 세포분열이 활발히 일어날 수 있었고, 배양 4주 후에는 미세 캘러스 (micro callus)< 형성할 수 있었다 (Table 1). 처음 분리된 원형질체 (Figure 5A, 5B)는 배양 5~10일 경과 후부터 구형의 모습이 변형되면서 대부분 첫 세포분열 (Figure 5C)을 시작하였으며 시간이 경과됨에 따라 지속적인 세포분열이 일어나 (Figure 5D), 배양 3주 후에는 microcolony# 형성 (Figure 5E, 5F)하였다.
이로써, 애기장대의 현탁배양 세포괴로부터 분리된 원형질체를 효율적으로 분리하고 양육배양방법으로 배양함으로써 체세포배 형성없이 기내 (in vitro) 기관분화 (organogenesis) 와 형태형성으로 식물체 재분화를 이룰 수 있었다.
현탁배양 세포로부터 분리한 원형질체를 배양하여 유도된 캘러스에서 표면이 매끈하고 잘 떨어지는 SF 캘러스 (Figure 7A)를 형태적으로 선별하여 다양한 농도의 IAA, 2ip 그리고 kinetin이 첨가된 재분화 배지에서 4주동안 배양한 결과 (Table 2), 0.05 mg/L IAA와 7 mg/L 2ip가 첨가된 배지에서 60%의 높은 shoot 형성률을 나타냈으며 auxin에 대한 cytokinin의 비율을 증가시킴으로써 shoot 형성이 촉진됨을 확인할 수 있었다. 또한 발생 양상은 SF 캘러스를 재분화 배지로 옮긴 후 녹화 (Figure 7B)되기 시작하여 구형배와 유사한 형태의 구조를 관찰할 수 있었으며 (Figure 7C), 배양이 진전됨에 따라 3주 후에는 shoot를 형성하기 시작하였다 (Figure 7D).
후속연구
고등식물의 세포로부터 많은 양의 원형질체를 효율적으로 분리할 수 있는 가능성이 증명된 이래 (Cocking 1961) 원형 실체는 유전자 운반 (gene transfer), 유전자 발현 (gene expression), 체세포잡종 및 식물 바이러스학의 실험재료로도 비교적 널리 이용되어 왔으며, 식물분자 생물학 및 유전공학 등의 발전을 가능하게 하였다. 정상적인 식물세포를 분리하여 배양하는 일은 쉽지 않으나, 원형질체 단세포의 분리, 배양, 분열과 증식은 비교적 용이하기 때문에 최근에는 이 방법에 대한 연구가 활기를 띠고 있으며, 원형질체와 관련된 배양기술을 통한 식물체의 재배는 담배속, 페츄니아속, 고추속 등의 가지과나 국화과 등의 제한된 종내에서 이루어지고 있으며(Shepard et al. 1980), 육종개발의 관점에서도 원형질체 배양을 통한 체세포잡종 식물체의 형성을 적용시킨다면 식물체내의 커다란 유전적 개선을 가져올 수 있을 것이다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 십자화과에 속하는 식물 (Koncz et al.
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