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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 토양 중에서 분리한 토양미생물 및 잔디 추출액에 의하여 dicamba의 분해정도 및 분해과정을 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- Dicamba를 잔디에 처리하였을 때 dicamba가 잔디 내로 이행하여 분해되는 과정을 확인하고자 잔디 중에 함유된 효소 군을 phosphate buffer를 이용하여 추출한 다음 이 추출액에 dicamba를 처리하고 37℃에서 배양하면서 in vitro 실험을 통해 dicamba의 분해를 검토한 결과는 그림 2와 표 4과 같다. 10 ppm 농도로 처리되었을 때에는 dicamba 의 반감기가 2.
- 추출액 전량을 진공회전농축기를 이용하여 추출액이 5 남을 때까지 감압농축한 다음 diazomethane 용액(ethyl ether) 5 m2 를 넣고 methylation 하였다. Methylation 후에 이 액을 10%의 물로 불활성화된 silica gel 5 응이 충전된 column에 옮겨 분해되지 않은 dicamba를 분석하기 위하여 1차로 ethyl ether - hexane (5 : 95, v/v) 혼합용액 50 ㎖로 용출시켜 받고 다시 dicamba 및 대사산물을 분석하기 위하여 아hyl ether - hexane (20 : 80, v/v) 혼합용액 150 ㎖로 용출하여 받은 다음 각각 감압농축하여 GLC/ECD로 분석하였다.
- 5 mM NaClz 10 mM NazHPQ, 10 mM KH2PO4/ 15 g Agar, 1 Q 증류수] (Kiyohara 등, 1982) 에 도말한 다음 30± VC 의 항온 기내에서 3일간 배양하였다. 배양 후 분리균을 10 ppm dicamba가 함유된 MM2 무기배지에 접종하고 매 2주 간격으로 10 ppm dicamba 1 ㎖ 씩 2회 처리한 다음 각분리균 배지내의 colony# nutrient broth (NB) 사면배지 (5 g peptone, 3 g beef extract, 1 I 증류수)에 접종하였다.
- 이 건고물을 gas-liquid chromatography (GLC)> 이용하여 모화합물인 dicamba 및 분해산물을 분석하기 위하여 pentafluorobenzylation (PFB benzylation)-g- 수행하였다. 즉 농축액에 pentafluorobenzyl bromide 1 ㎕ 와 0.
- 0) 150 를 Waring blender 에넣고 10, 000 rpm으로 3분간 마쇄한 다음 gauze로 1차 여과하고 Buchner funnel을 이용하여 흡인여과하였다. 이 여액에 dicamba를 10 ppm과 20 ppm 수준으로 처리하고 37℃ 의 항온기내에서 배양하면서 배양 L 3, 5, 7, 9일 후의 시료를 채취하여 전량을 500 ㎖ 증류 flask에 넣고 IN hydrochloric acid 150 ㎖를 첨가한 후 95 ℃ 에서 1 시간동안 환류시켰다 환류 후 추출액을 실온까지 냉각시킨 다음 500 분액여두에 옮기고 4 N potassium hydroxide 50 ㎖를 넣은 후 격렬하게 흔들어 pH가 8 이상이 되는지 확인한 후 20분간 방치하였다. 이 액에 sodium chloride 20 g을 넣고 다시 6 N hydrochloric acid을 사용하여 pH 1이하로 조절한 다음 ethyl ether 50 ㎖를 넣고 1분간 격렬하게 진탕분배하였다 이 때 ethyl ether 층은 anhydrous sodium sulfate 에 통과시켜모아 두고 상기 조작을 2회 반복 추출하였다.
- 반응액을 1 N hydrochloric acid로 중화한 다음 toluene 1 로 3회 추출하였다. 이 추출액을 진공회전농축기를 이용하여 농축, 건고한 후 n-hexaiie 10 ㎖로 재용해하고 GLC를 이용하여 모 화합물인 dicamba 및 분해산물을 분석하였다. 이때 사용된 기기로는 electron capture detector (eNi, ECD) 가 부착된 GLC (HP 5890 series II Plus, USA) 였으며, column 으로는 SE-30 (2 mm ID x 2 m L) 을 사용하였다.
- 토양으로부터 enrichment culture를 이용하여 dicamba 분해균을 분리하였으며, dicamba 분해균은 dicamba를 유일한 탄소원으로 첨가한 MM2 무기배지에 접종한 다음 증식된 5 균주를 분리하였다. 이들 분리 균주는 Microlog system을 이용하여 동정한 결과 표 1에서 보는 바와 같이 DK 1과 DD 2가 Acidovorax sp, 와 유사도가 각각 0.
대상 데이터
- 본 시험에 사용된 dicamba (순도 96.0%) 및 대사산물은 일본 SDS사로 부터 분양받아 사용하였으며, pentafluorobenzyl bromide는 Sigma사 (미국) 제품을 구입하여 사용하였다. 한편 미생물 분리를 위하여 채취된 토양은 골프장 인근 지역에서 1996년 3월부터 5월까지 양토 및 사양토 각각 5점을 채취하여 실시하였으며, 잔디 또한 골프장에서 한국 잔디를 채취하였다.
- 0%) 및 대사산물은 일본 SDS사로 부터 분양받아 사용하였으며, pentafluorobenzyl bromide는 Sigma사 (미국) 제품을 구입하여 사용하였다. 한편 미생물 분리를 위하여 채취된 토양은 골프장 인근 지역에서 1996년 3월부터 5월까지 양토 및 사양토 각각 5점을 채취하여 실시하였으며, 잔디 또한 골프장에서 한국 잔디를 채취하였다.
이론/모형
- 150 rpm의 속도로 2주간 배양하였다. 배양 후 dicamba 및 대사산물의 분석은 Carroll 등 (1993)과 Smith (1973) 의 방법에 준하여 수행하였다 즉 시료 전량을 증류수 100 ㎖로 1시간동안 초음파 추출한 후 추출액 전량을 250 분액여 두에 옮긴 다음 dicHoro-methane 40 ㎖ 를 넣고 분배하였다. 이때 dichloromethane층은 버렸고, 수상층에 sodium chloride 15 g을 첨가하고 ethyl acetate 50 mg 를 부가한 다음 다시 분배하여 추출하였다.
- 분리 미생물의 동정은 Microlog system (Biolog, 3.5) 를 이용하여 세균의 영양 이용성과 유사도를 조사하였으며, 이들 균의 주요 생리적 특성은 Collins 등 (1995)의 방법에 따라 조사하였다.
성능/효과
- 따라서 dicamba는 토양중에서의 반감기가 14~25일인 점을 감안하면 dicamba는 토양미생물에 의해 분해되는 속도보다 식물체내에서 분해되는 속도가 빠른 것으로 보인다.
- 따라서 본 연구의 결과를 종합하여 보면 dicamba를 잔디에 살포하였을 때 dicamba는 토양 중의 dicamba 분해 미생물에 의해 쉽게 가수분해될 수 있으며, 또한 잔디에 흡수된 후에도 잔디 중에 존재하는 효소군에 의해 가수분해되는 것으로 판단되었다.
- 따라서 순수배양에서 dicamba를 단독 탄소원으로 처리될 때에는 토양미생물에 의해서 쉽게 이용되고 분해되며, 그 대사작용은 hydroxylation 및 demethylation 에 의하여 분해되는 것으로 확인되었다. Krueger 등 (1989)이 단독 탄소 원으로 dicamba를 이용할 수 있는 8종의 토양세균을 enrichment culture 에 의하여 분리한 후 dicamba의 분해성을 검토한 결과 액체배지내에서 dicamba의 주요 분해균으로 Pseudomonas 야), 및 Moraxella sp.
- 또한 이들 분리 균주의 각각의 특성을 Bergey's manual (Holt, 1994)의 방법에 따라 확인한 결과 DK 1과 DD 2는 Acidavorax 속과 일치하는 gram negative, rod 모양의 세포형태, 반응성도 액체배지 내의 운동성, 산화효소 반응성 및 poly- H -hydroxybutyrate 축적성 모두 양성반응을 나타내었다. 또한 DK 2 및 DD 3도 Variovorax 속과 특성이 일치하였으며/ yellow colony 이었다. 한편 DD 1과 Alcaligenes 속을 비교한 결과 gram negative, rod 모양/ 액체배지내의 운동성 및 0 -hydroxybutyrate 이용성 이 양성으로써 일치 하였다 (표 2).
- 88 로서 매우 높은 유사도를 보여 주었다. 또한 이들 분리 균주의 각각의 특성을 Bergey's manual (Holt, 1994)의 방법에 따라 확인한 결과 DK 1과 DD 2는 Acidavorax 속과 일치하는 gram negative, rod 모양의 세포형태, 반응성도 액체배지 내의 운동성, 산화효소 반응성 및 poly- H -hydroxybutyrate 축적성 모두 양성반응을 나타내었다. 또한 DK 2 및 DD 3도 Variovorax 속과 특성이 일치하였으며/ yellow colony 이었다.
- 같다. 분리균은 dicamba를 유일한 탄소원으로 첨가한 MM2 무기 배지에 접종한 다음 21일 후에 분석한 결과 이들 분리균모두 dicamba를 85.7%—96.6% 분해하였으며, DD1 과 DD2를 접종한 배지에서 dicamba의 분해산물인 5-hydroxydicamba (5-OH dicamba, 0.51%~0.6%)를 검출하였다 (그림 1).
- 한편 이들 분리균이 탄소원이 존재하는 유기 배지 내에서도 dicamba를 분해시킬 수 있는지를 확인한 결과 DD 1을 접종한 배지에서 dicamba를 89.93% 분해시켰으며, 나머지 균주에서도 21.24~31.6%의 높은 분해력을 보여주었다.
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