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문제 정의
- 인공 수정한 개불 (". 讥cf“s)의 난자를 재료로 한 본 연구에서는 수정 초기반응에서 1차 수정 막이 형성되고 이후 피질과립 반응에 의해 2, 3차 수정막이 형성되는 것이 관찰되었으며 그 결과 미세융모에 정자 수용체가 존재하는 것으로 추측할 수 있었다 따라서 본 연구에서는 인공 수정 후 여러 단계의 수정막 형성에 따른 물질적 기원과 첨체반응 및 이에 연관된 구조 변화에 대하여 보고하고자 하며 미세융모의 정자 수용체에 대하여 고찰하고자 한다.
- 본 연구에서는 개불 (U. unicinctus)의 첨체 반응과 수정막 형성 단계를 관찰하고 수정 전 후의 미세구조 변화를 비교한 결과, 난자 미세융모에 정자 수용체가 존재하는 것으로 생각되었으므로 이에 관하여 고찰하고자 한다.
제안 방법
- 7). 이때 1 차 수정막은 더욱 확장되고 주로 물질의 농도와 미세구조에 따라 5개 층으로 구분할 수 있는데 (Figs. 7, 9), 이와 연관된 수정막을 본 연구에서는 최종 3차 수정막 형성과 관련하여 "2차 수정막”이라고 하였다. 2 차 수정막 형성의 최종 단계에는 5개 층을 형성하며 (Fig.
- 난자는 여과된 해수에 처리하여 침져하는 난자만을 선별하였고 또한 성숙 난자(100〜150]㎖)를 얻기 위해 나일론 망 (nylon mesh, 100 |im)에 혀 과되 지 않는 난자만을 사용하였다. 인공수정은 수청의 여러 단계를 관찰하기 위해서 자연해수의 염분도 보다 다소 높은 25%。, 그리고 다소 낮은 온도인' 16°C의 milli pore 여과 해수를 사용하였으며, 난자:성]수= 1:100으로 희석하고, 정자 : 난자 = 1 : 500이 되도록 조절하였다. 인공 수정한 후 10분이 경과하면 광학현미경으로 관찰한 정자의 활성이 급격히 감소하였으므로 해수를 교환하여 활성이 없는 과잉 정자룔 제거하였다.
- 7, 9), 이와 연관된 수정막을 본 연구에서는 최종 3차 수정막 형성과 관련하여 "2차 수정막”이라고 하였다. 2 차 수정막 형성의 최종 단계에는 5개 층을 형성하며 (Fig. 9), 이 층을 본 연구에서는 서술의 편의상 난자의 외부로부터 내부를 향하여 각각 1〜5층으로 기술하고자 한다.
- 개불 난자를 인공 수정한 후, 첨체반응과 연관된 구조의 변화와 수정막의 형성, 그리고 난세포질 속의 정자 핵의 구조 변화를 주로 관찰하였다. 수정막 형성은 피질과립 분비에 따른 그 수의 감소와 미세구조 변화를 내용으로 하고 있으며 미세융모의 감소와 형태 변화를 수반하고 있다.
- , 타라서 정자는 해수와 접촉시키고 그 활성을 확인한 후 사용하였다. 난자는 여과된 해수에 처리하여 침져하는 난자만을 선별하였고 또한 성숙 난자(100〜150]㎖)를 얻기 위해 나일론 망 (nylon mesh, 100 |im)에 혀 과되 지 않는 난자만을 사용하였다. 인공수정은 수청의 여러 단계를 관찰하기 위해서 자연해수의 염분도 보다 다소 높은 25%。, 그리고 다소 낮은 온도인' 16°C의 milli pore 여과 해수를 사용하였으며, 난자:성]수= 1:100으로 희석하고, 정자 : 난자 = 1 : 500이 되도록 조절하였다.
- 대조군인 미수정란과 수정란인 실험군은 모두 인산 완충용액 (0.1 M, pH 7.4)으로 희석한 2% 포르말린에 1차로 처리하고, 10분 후에 고정액을 교환하였으며 VC에서 약 14일간 전고정하였다. 재료는 인산 완충액에 희석한 1% 오스미움 산에서 각각 2시간 후 고정하였고 같은 완충액으로 1시간씩 2회 수세 하였다.
- 이후 재료는 알코올 농도 상승순에 따라 각 10분간 탈수하였으며 propylene oxide와 Epon 812 혼합물에서 15분간 2회 치환하고 Epon 812에 포매하였다. 박 절편 (l|xm)은 toluidine blue로 염색하였고, 70~90 pm 의 초박절편은 uranyl acetate와 lead citrate에 염색하고 JEOL 1010B 전자현미경으로 80KV하에서 관찰하였다.
- 4)으로 희석한 2% 포르말린에 1차로 처리하고, 10분 후에 고정액을 교환하였으며 VC에서 약 14일간 전고정하였다. 재료는 인산 완충액에 희석한 1% 오스미움 산에서 각각 2시간 후 고정하였고 같은 완충액으로 1시간씩 2회 수세 하였다. 이후 재료는 알코올 농도 상승순에 따라 각 10분간 탈수하였으며 propylene oxide와 Epon 812 혼합물에서 15분간 2회 치환하고 Epon 812에 포매하였다.
대상 데이터
- 본 실험의 재료인 개불은 순환적 생식 주기에 따라 성숙 정자와 난자가 각각 정소와 난소에 채워지는 시기인 1997년 5월과 6월 사이에 충남 서산군 몽산포 일대의 해안 개펄 층에서 채집한 것을 사용하거나 또는 채집 후 실험실에서 15〜 17°C의 수온을 유지하고 플랑크톤 먹이를 공급하며 사육한 것을 사용하였다. 재료를 사육한 경우에 사용한 생식세포는 채집 당시의 활성과 형태적 특징을 뵤이는 것을 선별하여 사용하였다.
- 인공 수정한 후 10분이 경과하면 광학현미경으로 관찰한 정자의 활성이 급격히 감소하였으므로 해수를 교환하여 활성이 없는 과잉 정자룔 제거하였다. 실험군에 따른 수정과 수정시간은 광학현미경으로 확인하였고, 전자현미경 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 것은 주로 난소의 체벽, 즉 소공 근위부에서 채취한 것을 사용하였으며 해수에 대한 밀도에 의해 선별하고 나일론 망(nylon mesh)으로 여과하여 100 ptm 이상의 성숙 난자만 사용하였다. 이 난자들의 세포막은 만입 (invagination) 되고 핵 막은 함입 (indentation)되 어 있으나, 이는 난자의 밀도와 해수 농도에 의존적이었으므로, 해수로 처리하여 구형을 회복한 난자들을 사용하였다.
- 불순물을 제거하였다. 인공수정시 여러 실험군샤;헤의 동시성을 고려하여 자웅 각각 1개체에서만 얻은 정자 및 난자만을 사용하였다.
- 재료를 사육한 경우에 사용한 생식세포는 채집 당시의 활성과 형태적 특징을 뵤이는 것을 선별하여 사용하였다. 이 동물의 외부 형태로는 자웅의 구별이 어려우나 생식주기에는 서로 타른 색의 정소와 난소가 발달하므로 자웅의 구별이 용이하다.
- 채집한 정소 및 난소는 miljpore (0.45 卩m)로 여 과한 자연 해수에 세척하여 혈구 및 기라. 불순물을 제거하였다.
이론/모형
- 따라서 1차 수정막 형성시 첨체돌기 전단부에서 관찰된 막성 구조는 수정 직후 수축하는 미세융모와 깊은 관계가 있는 구조인 것으로 생각되었다. 본 연구에서는 수정막 속의 1, 2차 극체와 난 세포질에서 정자 핵의 구조변화(Longo & Anderson, 1968; 1970)로서 수정의 사실을 확인한 바 있고, 난 표층 위로 돌출하였던 미세융모들의 구조 변화와, 이와 동시적 사건인 1차 수정막의 두께 증가로 인하여 미세 융모들이 1차 수정막 속으로 수축하는 일련의 반응이 정자 수용체의 불활성화와 연관 (Sato & Osanai, 1986)되는 것으로 생각할 수 있었다. 또한 개불 미수정란 난외막의 두께는 2〜3㎖이고 수정 이 보다 두꺼운 난외막을 갖고 1차, 2차 결합으로 이루어지는 동물의 경우와는 다소 다른 것으로 보인다.
성능/효과
- 1차 수정막은 표층 (0.5jxm)과 위란강 등 난 외막은 확장되고, 그 내부에는 크기가 일정하지 않은 막 성 구형 구조가 출현하며, 미세융모들이 수축하는 것이 특징적으로 관찰되었다 (Fig. 6). 1차 수정막의 표층은미수정난 표층 (surface coat) 의 입자상 물질 이 안쪽으로 확산해서 형성되는 것으로 보인다.
- 최종 수정막이 2개 층으로 구분되는 예는 성게에서 관찰된 바 있고, 그 외층과 내층을 각각 activation calyx와 chorion으로 명명되었으므로(Anderson, 1968), 개불의 피질과립 반응이 성게와 매우 유사한 것으로 보아서 그 물질적 구성도 유사할 것으로 추측하였다. 그러나 개불의 경우 1, 2차 수정막 등 수정막 형성의 중간단계는 본 연구의 실험적 조건 (염분도 25%。, 온도 16°C)에서 관찰된 것이므로 성게 혹은 U. caupo에서도 유사한 실험 조건에서는 수정막 형성의 중간 단계가 있을 것으로 생각할 수 있었다. 이러한 사실은 개불이 환형동물 혹은 극피동물에 속하는가의 논란에서, 수정의 사건에서 보면 극피동물과 유사하다는 것을 알 수 있는 것이었으며, 이는 개불의 난할이 나선형 난할 (spiral cleavage pattern)로서 난할유형 으로 본 분류적 위 치 가 환형동물보다는 극피동물과 유사성이 있다는 보고 (Shin, 1997, 1998)와 연관된 것으로 생각되었다.
- 난자는 체강에 자유세포로 존재하는 것과 난소에서 축적된 성숙 난자들이 있으며, 난소의 근위부 혹은 원위부에 따라서 난자의 성숙도가 다른 것으로 관찰되었다. 실험에 사용한 것은 주로 난소의 체벽, 즉 소공 근위부에서 채취한 것을 사용하였으며 해수에 대한 밀도에 의해 선별하고 나일론 망(nylon mesh)으로 여과하여 100 ptm 이상의 성숙 난자만 사용하였다.
- 어려웠다. 수정으로 인한 난세포질의 반응은 5개 층으로 구분되는 2차 수정막이 형성될 때이었으며, 난자 피질부의 피질과립 이 미세입자상 물질로 분비된 후 서로 혼합하는 과정을 통하여, 2개 층으로 구분되는 최종 3차 수정막이 형성되는 것으로 관찰되었다. 피질과립 물질이 위란강에 분비되어서 수정막을 형성하는 것은 개불의 다른 종류인 U.
- 8jxm)이 1차 수정막 외층과 접촉한다. 이때 첨체를 구성하는 물질의 농도 혹은 밀도는 약해지고 농도 구배도 점차 볼 수 없게 되며 첨체 간격과 그 안쪽으로부터 첨체 미세소관 (acrosomal tubule) 이발 달하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 이때 첨체 미세소관의 기부는 첨체 내막에 밀착하고 있다.
- 5). 중편을 구성하는 주요 구조는 미토콘드리아와 기부 및 단부 중심소체이며 미토콘드리 아의 크리스테는 관상형 (tubular type)인 것으로 관찰되었다. 중심체들은 미토콘드리아와 핵사이의 간격 인 posterior nuclear fossa (300 x 580 x600nm)에서 볼 수 있다(Figs.
- 2). 한편 수정 막 외부에는 형태적으로 활성이 약한 것으로 보이는 다수의 정자를 볼 수 있었으나 약 30분 후에 그 수는 현저하게 감소하는 것으로 관찰되었다.
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