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고등어 유래 항고혈압 peptide의 분리 정제
Separation and Purification of Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory peptide from Mackerel 원문보기

한국수산학회지 = Journal of the Korean Fisheries Society, v.33 no.2, 2000년, pp.153 - 157  

도정룡 (한국식품개발연구원)

초록
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고등어 유래의 peptide를 제조하고, Sephadex G-25 column, ODS AQ column, Vydac column, Superdex peptide column을 이용하여 순차적으로 분리, 정제하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 고등어 선어로부터 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 얻은 고등어육의 수율은 $65.5{\%}$였으며, 고등어육의 단백질 함량은 $63.3{\%}$, 그리고 지질함량은 $32.6{\%}$로 나타났다. 지질을 제거하기 위하여 알칼리 처리한 후 동결 건조한 고등어 단백질의 수율은 고등어 육에 대하여 $18.2{\%}$로 나타났고, 고등어 단백질을 효소가수분해하여 제조한 고등어 가수분해물의 수율은 $50.6{\%}$로 나타났다. 고등어 가수분해물 cut-off 1만의 membrane으로 ultrafiltration한 결과, MW 10,000이하가 $79.6{\%}$, 10,000 이상이 $20.4{\%}$였으며, ACE저해효과는 10,000이하 획분이 10,000이상 획분보다 높은 것으로 나타났다. (Table 1). 1만 이하의 획분을 Sephadex G-25 column으로 분획하여, 7개의 획분을 얻었고 (Fig. 1), 이 가운데 MS2획분의 ACE 저해효과가 가장 높았다(Table 2). ACE 저해효과가 가장 좋은 MS2획분을 ODS AQ column으로 분획하석 4개의 획분으로 분획하였고 (Fig.2), 이 가운데 Ms2O3획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다 (Table 3). Ms2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 8개의 획분으로 분취하였다(Fig.3), 이 가운데 MS2O3V5획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다(Table 4). Superdex peptide column으로 재정제하여 얻은 peptide의 N-말단으로부터 아미노산 배열은 Tyr-Val-Ala으로 ACE저해활성은 IC-(50)이 $1.4{\mu}M$로 나타났다. Matsumura등 (1993)은 가다랭이 가수분해물로부터 분리한 6개의 peptides 가운데 tripeptide의 ACE저해활성이 높았다고 하였으며, 본 연구 결과에서도 유사한 경향을 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper 아이콘AI-Helper

Hydrolysate which inhibit the Angiotensin I-converting enzyme (ACE) was prepared from mackerel muscle by pretense. The ACE inhibitory activity of mackerel muscle hvdrolysate (MMH) was $967 {\mu}g of IC_(50)$. ACE inhibitory peptides were isolated by ultrafiltration, gel permeation column ...

주제어

#ACE inhibitory peptide   #Ultrafltration   #GPC   #RPC   #RP-HPLC   #GP-HPLC  

AI 본문요약
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* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

제안 방법

  • 1), 이 가운데 MS2획분의 ACE 저해효과가 가장 높았다 (Table 2). ACE 저해효과가 가장 좋은 MS2획분을 ODS AQ column으로 분획하여 4개의 획분으로 분획 하였고 (Fig. 2), 이 가운데 MS2O3획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다 (Table 3). MS2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 8개의 획분으로 분취하였다 (Fig.
  • ODS AQ column으로 분획한 peptide를 Vydac column (10X 250mm, Vt : 19.6ml)으로 분리정제하였다. 이때 용출액은 0.
  • Peptide의 함량은 Superdex peptide column을 장착한 AKTA explorer 100 (Pharmacia Biotech)을 이용하여 면적비로 계산하였다. Peptide 표품으로는 Angiotensin II (Sar-Arg-Val-Tyr-Ile- His-Pro-Phe, MW 1002.
  • Sephadex G-25 column으로 분획한 peptide를 ODS AQ를 충진한 column(26X300mm, Vt: 160 ml)으로 분리 정제하였다. 이때 용출액은 HPLC용 water를 A용매, HPLC용 ethanol을 B용매로하여 gradient조건에서 분리하였다.
  • Vydac C18 column으로 분획한 peptide를 Superdex peptide column (10X30mm, Vt : 24ml)을 이용하여 분리정제하였다. 이때 용출액은 HPLC용 water, 유속은 0.
  • 고등어 가수분해물을 cut-off 10,000 dalton의 membrane(YM10, Amicon Co.) 을 장착한 한외 여과장치 (Amicon Co)로 10, 000 dal-ton이상의 획분과 10, 000 dalton이하의 획분으로 분리하고 감압농축 후 진공동결 건조하여 고등어 peptide를 제조하였다.
  • 고등어 유래의 peptide를 제조하고, Sephadex G-25 column, ODS AQ column, Vydac column, Superdex peptide column을 이용하여 순차적으로 분리, 정제하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
  • 고등어 육에서 분리한 peptide의 아미노산 배열 분석은 Procise TM (Perkin Elmer, protein sequencing system, Foster, CA., USA)을 이용하였다. 분석시 Bio-Brene액을 처리하여 standard를 측정한 다음, 시료 20ul를 사용하여 분석하였다.
  • 고등어 peptide를 제조하기 위하여 탈지한 고등어 분말을 endo 형의 Papain 30,000으로 7℃에서 4시간 1차 가수분해하고, exo형의 Promod 192p효소로 50℃에서 2시간 2차가수분해 하였다. 그리고, 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분간 끓인 다음 규조토를 사용하여 감압 여과한 후 용액의 부피를 줄이기 위해 감압 농축하고 진공동결 건조하여 고등어 가수분해물 분말을 제조하였다.
  • 1% Na2CO3 용액을 첨가하고 콜로이드밀로 마쇄하였다. 다음으로 원심분리(7000Xg, 20분)하여 어육 잔사를 취하고 진공동결건조하여 탈지 분말을 제조하였다.
  • , 1993).본 연구에서는 고등어를 효소로 가수분해하여 항고혈압 기능성 peptide를 제조하여 Sephadex G-25 column, ODS AQ column, Vydac column, superdex peptide column을 이용하여 분리, 정제 하고 이들 peptide의 ACE저해효과를 조사하였다.
  • , USA)을 이용하였다. 분석시 Bio-Brene액을 처리하여 standard를 측정한 다음, 시료 20ul를 사용하여 분석하였다.
  • 1% TFA in acetonitrile(ACN)을 B용 매로하여 gradient 조건에서 분리하였다. 유속은 2ml/min로 용출 시켜 2畝씩 분취 하였으며, 215 nm, 280 nm에서 detection하고, 각 peak를 모아 감압농축한후 진공동결건조하였다.

대상 데이터

  • Angiotensin I-converting enzyme (ACE)는 토끼의 허파로부터 얻은 아세톤 침전분말 (Sigma Co.)을 사용하였고, 기질은 hippuryl-histidyl-leucine (Sigma Co.)을 사용하였다. 고등어육 가수분해에 사용한 Papain 30, 000은 Novo사, Promod 192p는 Gist-brocades 사에서 구입하여 사용하였다.
  • 11*12). MS202 (13~ 15). MS203 (24-28.
  • MS2O3V5획분을 Superdex peptide cohmm으로 정제하였으며(Fig. 5). MS2O3V5P시료로 하고 아미노산 배열을 조사하다.
  • 2), 이 가운데 MS2O3획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다 (Table 3). MS2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 8개의 획분으로 분취하였다 (Fig. 3). 이 가운데 MS2O3V5획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다 (Table 4).
  • 단백질 가수분해물로부터 peptide의 분리정제에 있어서 RPC에 의한 분리법은 매우 효과적인 방법으로 알려져 있다 (Herraiz, 1997). MS2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 MS2O3V1 (tube no 9), MS2O3V2 (tube no 21), MS2O3V3 (tube no 22-23), MS2O3V4 (tube no 24~25), MS2O3V5 (tube no 27-28), MS2O3 V6 (tube no 32-33), MS2O3V7 (tube no 35-36)그리고 MS2O3V 8 (tube no 49~50)획분으로 분취하였다 (Fig. 3). 이 가운데 MS2O 3V5획분의 ACE저해효과가 가장 높았다 (Table 4).
  • Peptide의 함량은 Superdex peptide column을 장착한 AKTA explorer 100 (Pharmacia Biotech)을 이용하여 면적비로 계산하였다. Peptide 표품으로는 Angiotensin II (Sar-Arg-Val-Tyr-Ile- His-Pro-Phe, MW 1002.2)를 사용하였다. peptide의 분자량도 Superdex peptide column으로 측정하였으며, 이때 사용한 pep­ tide 표품으로는 Cytochrome C(M.
  • 고등어육 가수분해에 사용한 Papain 30, 000은 Novo사, Promod 192p는 Gist-brocades 사에서 구입하여 사용하였다. Peptide의 분리정제에 사용한 용매는 HPLC용을 사용하였다.
  • 2)를 사용하였다. peptide의 분자량도 Superdex peptide column으로 측정하였으며, 이때 사용한 pep­ tide 표품으로는 Cytochrome C(M.W. 12, 500), Aprotinin (M. W. 6, 500), ACTH(M.W. 2, 934), Substance P(M.W. 1, 348), Angiotensin II(M.W. 1, 002)그리고 Glycyl-L-Leucine(M.W. 188)을 사용하였다.
  • )을 사용하였다. 고등어육 가수분해에 사용한 Papain 30, 000은 Novo사, Promod 192p는 Gist-brocades 사에서 구입하여 사용하였다. Peptide의 분리정제에 사용한 용매는 HPLC용을 사용하였다.
  • 본 실험에 사용한 고등어는 가락동 농수산물 시장에서 선도가 양호한 선어를 구입하여 사용하였으며, 사용한 고등어는 체장 32~33 cm, 체중 380~430g이었다. 시료의 전처리는 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 고등어육을 채취하였으며, 혈액 등 이물질을 제거 하기 위해 수세하였다.
  • 본 실험에 사용한 고등어는 가락동 농수산물 시장에서 선도가 양호한 선어를 구입하여 사용하였으며, 사용한 고등어는 체장 32~33 cm, 체중 380~430g이었다. 시료의 전처리는 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 고등어육을 채취하였으며, 혈액 등 이물질을 제거 하기 위해 수세하였다. 지질을 제거하기 위하여 4배량의 알칼리용액(0.

이론/모형

  • ACE저해작용의 측정은 Cushman과 Cheung (1971)의 방법으로 측정하였다. 즉, 소정농도의 시료 50ul에 ACE 조효소액 50ul및 sodium borate buffer (pH 8.
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