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문제 정의
- 본 연구자들은 우리나라 전국 산림의 27%를 점유⑺하고있는 신갈, 갈참, 졸참 및 떡갈나무등과 같은 참나무의 항균력을 조사한 결과 신갈나무 잎 추출물이 가장 강한 항균력을 나타냄을 보고(8)하였기에 본 논문에서는 신갈나무 잎 추출물의 천연보존제의 개발 가능성을 탐색하기 위하여 신갈나무 잎의 추출용매별 항균력 및 수율효과를 조사하고 기존에 천연항균제로 많이 이용되고 있는 유기산과의 병용처리시 항균특성에 대해 조사하였다.
제안 방법
- 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 유기산인 젖산, 구연산 및 초산을 각각 312.5, 625, 1250, 2500, 5000 μg/ml의 농도로하여 membrane filter(Whatman No. 2, 0.45 pore size) 로 제균시켰다. 이를 TSB배지에 유기산과 신갈나무 추출물을 혼합 처리하여 첨가하고, Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria monocytogenes ATCC 19111 및 Escherichia coli 0157 : H7 0019균의 농도를 105 CFU/mL로 접종하여 MIC 및 생육저해효과를 측정하였다.
- 분주하여 2중의 평판배지를 만들었다. 신갈나무 잎 추출물을 멸균된 paper disk에 일정량씩 흡수시킨 후 시험용 평판배지 표면에 올려놓은 다음 35℃ incubatoi에서 24-48시간동안 배양한 다음 disk 주변의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력을 검색하였다.한편, minimal inhibitory concentrations (MIC) 측정은 동결건조한 각 추출물을 dimethylsulfoxide (DMSO)로 녹 인 후 0.
- 신갈나무 잎의 추출은 수직으로 환류냉각관을 부착시킨 flask내에 분말시료를 넣고 시료중량의 10배량의 증류수, 75% 에탄올 및 메탄올을 추출용매로 사용하여 추출온도를 30, 60, 90℃로 6시간 2회 추출한 후 감압여과장치로 여과하였다. 여액을 rotary vacuum evaporator(EYELA N-N-SERIES, japan)를 사용하여 농축하고 이를 동결건조한 후 밀봉하여 4℃의냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 45 pore size) 로 제균시켰다. 이를 TSB배지에 유기산과 신갈나무 추출물을 혼합 처리하여 첨가하고, Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria monocytogenes ATCC 19111 및 Escherichia coli 0157 : H7 0019균의 농도를 105 CFU/mL로 접종하여 MIC 및 생육저해효과를 측정하였다.
- 항균시험은 멸균된 TSB 배지를 petridish에 15 mL씩 분주하여 응고시키고, 중층용 배지를 각각 5 ml씩 시험관에 분주하여 멸균한 후, 50℃ 수욕상에 보관하면서 전배양한 각종 시험균액을 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지위에 분주하여 2중의 평판배지를 만들었다. 신갈나무 잎 추출물을 멸균된 paper disk에 일정량씩 흡수시킨 후 시험용 평판배지 표면에 올려놓은 다음 35℃ incubatoi에서 24-48시간동안 배양한 다음 disk 주변의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력을 검색하였다.
대상 데이터
- 강원도 지역에서 1998년 5월부터 9월에 채취한 신갈나무잎 시료는 먼지 등을 제거하기 위해 깨끗한 물로 수세한 후 원적외선건조기(Dry of far infrared ray, KFD-101B)로 60℃에서 12시간 건조한 후, 건식분쇄기(삼성전기, CR-581W)로 분쇄하고, 표준체 150 mesh(Standard testing sieve, ITOH Co., Tokyo)로 체를 친 다음 균질한 분말시료를 추출용 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 Bacillus subtilis ATCC 6633,Bacillus cereus ATCC 9634, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes ATCC 19111, Listeria monocytogenes ATCC 43256, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Listeria monocytogenes ELM, Listeria monocytoge nes F5027, Listeria monocytogenes F5069, Listeria monocy togenes TY16, Listeria monocytogenes Scott A, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli 0157: H7 0019, Escherichia coli 0157: H7 933, Escherichia coli 0157 : H7 932, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853균이다.각 균주는 tryptic soy agar(Difco, USA) slant에 계대배양하여 보관하였으며,필요시 tryptic soy broth(Difco, USA)에접종하여 35"C에서 24시간 배양하면서 활성화시켜 사용하였다.
성능/효과
- coli 0157 : H7균에 대하여는 물 추출물과 마찬가지로 항균력이 현저하게 떨어졌다(Table 3). B. cereus 및 S. aureus균에 대한 메탄올 추출물에 대한 MIC는 각각 500 및 125μg/mL 를 나타냈고 L. monocytogenesee 대해서는 ATCC 19111 및 F5027 균에서 만 62.5 μg/mL의 MIC를 나타내 었으며 L. monocytogenes ATCC 43256균에 대해서는 500μg/mL에서 MIC를 나타내어 물과 에탄올 추출물에 비하여 항균력이 다소 떨어짐을 보였다(Eble 4). 그러나 S.
- coli 0157: H7 0019 에 대한 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 유기산과의 병용처리시 최소저해농도를 검색한 결과이다. B. subtilis ATCC 6633, L. monocytogenes ATCC 19111 및 E. coli 0157: H7 0019균 에 대한 젖산, 구연산 및 초산의 최소저해농도는 모든균에 대하여 각각 2500, 5000 및 1250|ig/mL이었고 신갈나무 잎 에탄올 추출물은 B. subtilis ATCC 6633와 L. monocytogenes ATCC 19111균에는 125 ㎍/mL, E. coli 0157 : H7 0019균에는 500㎍/mL의 MIC를 나타내었다. Sorrells(11) 등은 동일한 pH하에서 L.
- coli 0157 : H7 균에 대하여는 500㎍/mLL 이상에서 최소저해농도를 나타내었다. B. subtilis ATCC 6633균과 L. monocytogenes ATCC 19111균에 대한 젖산, 구연산, 초산 및 신갈나무 잎 에탄올 추출물의 최소저해농도는 두균모두 각각 2, 500, 5, 000, 1, 250 및 125 ㎍/mL이었으며 이들의 병용처리시 B. subtilis ATCC 6633균에는 효과가 없었으나 L. monocytogenes ATCC 19111균에 대하여는 상승항균효과를 나타내었다. 한편, 각각의 sub-lethal 농도에서 E.
- monocytogenes ATCC 19111에 대한 최소저해농도를 조사한 결과는 Table 6 및 7과 같다. B. subtilis ATCC 6633에 대한 각각의 유기산과 신갈나무 잎 에탄올 추출물의 병용처리는 각각의 단독처리와 비교하여 최소저해농도의 차이가 없었으나 L. monocytogenes ATCC 19111균에 대하여는 3종류의 유기산 모두 단독처리시에 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 병용처리시 현저한 상승효과가 나타났다. 한편, 이러한 병용처리효과의 MIC농도를 기준으로 하여 E.
- 1에 나타내었다. 각 유기산과 신갈나무 잎 에탄올 추출물을 sub-lethal 농도에서 병용처리한 결과 이들의 병용처리는 E. coli 0157 : H7 0019균의 생육억제에 항균효과가 없는 것으로 나타났으며 신갈나무 잎 에탄올 추출물의 최소저해농도인 500㎍/mL의 농도에서 48시간동안 배양시 생육이 완전히 저해되었다. 따라서 본 연구결과, 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 유기산의 병용처리효과는 B.
- coli 0157 : H7 0019균의 생육억제에 항균효과가 없는 것으로 나타났으며 신갈나무 잎 에탄올 추출물의 최소저해농도인 500㎍/mL의 농도에서 48시간동안 배양시 생육이 완전히 저해되었다. 따라서 본 연구결과, 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 유기산의 병용처리효과는 B. subtilis ATCC 6633과 E. coli 0157 :H7 0019균에는 없었으나 L. monocytogenes ATCC 19111에는 상승효과를 나타냄으로써 균종에 따라 차이가 있음을 알 수 있다.
- aemginosa균은 250 μg/mL 농도에서 각각 MIC를 나타내었다. 따라서, 신갈나무 잎 물 추출물은 그람음성균에 비해 그람양성균에 보다 강한 항균력 나타내었다. 신갈나무 잎 에탄올 추출물에서는 물추출물에 비하여 B.
- 물을 용매로 하여 추출온도를 달리하여 추출 수율을 조사한 결과, 추출온도가 3CTC와 90℃에서 보다는 6<yc에서 2~4%의 높을 수율을 얻었다. 또한, 물 추출의경우 추출온도가 낮을 때는-식물체- 안에 들어있는 성분들의 용출 시간이 길어지는 반면에, 추출온도가 높을 때에는 신갈나무 잎 성분 중 점액질이 다량 용출되어 여과되지 않아 추출 수율이 낮았다. 에탄올을 용매로 하여 추출한 경우는 물 추출보다 수율이 2~4% 정도로 높았으나 온도변화에 따른 추출 수율은 물 추출과 같이 60℃에서 가장 높았다.
- subtilis외 17종의 피검균에 대하여 항균력을 검색한 결과는 Table 1과 같다. 물을 용매로 하여 추출온도를 달리하여 추출 수율을 조사한 결과, 추출온도가 3CTC와 90℃에서 보다는 6<yc에서 2~4%의 높을 수율을 얻었다. 또한, 물 추출의경우 추출온도가 낮을 때는-식물체- 안에 들어있는 성분들의 용출 시간이 길어지는 반면에, 추출온도가 높을 때에는 신갈나무 잎 성분 중 점액질이 다량 용출되어 여과되지 않아 추출 수율이 낮았다.
- 또한, 열 저항성과 산성에 대한 내성이 있으며 저온에서도 생육이 가능한 저온성세균으로 냉장식품에서 많은 문제가 되고 있다(9) .본 연구 결과에 의하면 신갈나무 잎의 에탄올 추출물이 모든 균종에 대하여폭넓은 항균활성을 나타내고 있어- 천연 항균물질로서의 이용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- Table 2와 같다. 신갈나무 잎 물추출물은 다른 세균에 비하여 L. monocytogenes균에 특히 강한 항균력을 나타내었으며 같은 균이라도 균종에 따라 항균력의 차이가 났다. 특히, E.
- 유기산의 항균활성은 비해리된 유기산의 작용 때문이며, 비해리된 유기산은 세포 내부로 수송되어 세포의 pH를 변화시켜 세포 내 효소의 변성 을 초래한다고 알려져 있다(12). 신갈나무 잎 에탄올 추출 B. subtilis ATCC 6633 및 L. monocytogenes ATCC 19111 균에 대해 125 ㎍/mL 최소저해농도를 나타내었으나, E. coli 0157 : H7 0019균에 대하여는 500 ㎍/mL의 최소저해농도를 나타내었다.
- 따라서, 신갈나무 잎 물 추출물은 그람음성균에 비해 그람양성균에 보다 강한 항균력 나타내었다. 신갈나무 잎 에탄올 추출물에서는 물추출물에 비하여 B. ceress와 L. monocy- togeaes균같은 그람양성균에 더 강한 항균력을 나타냈으나 E. coli 0157 : H7균에 대하여는 물 추출물과 마찬가지로 항균력이 현저하게 떨어졌다(Table 3). B.
- 신갈나무 잎 에탄올 추출물은 그람양성균인 B.cereus, S. aureus 그리고 L. monocytogenes균에 대하여 62.5~125㎍/mL 범위에서 최소저해농도를 나타내었으나 그람음 성균인 S. trphmuriuwn과 P. aeruginosa 균은 250 ㎍/mL, E. coli 0157 : H7 균에 대하여는 500㎍/mLL 이상에서 최소저해농도를 나타내었다. B.
- 신갈나무 잎 추출물의 항균력은 추출 온도별로는 60℃에서 추출시 3℃와 90℃에 추출하는 것보다 약간 더 높은 활성을 나타내었으며 추출 용매별로는 에탄올로 추출한 경우가 물 또는 메탄올 추출물보다 대체로 높은 항균활성을 나타내었다. 신갈나무 잎 에탄올 추출물은 그람양성균인 B.
- 또한, 물 추출의경우 추출온도가 낮을 때는-식물체- 안에 들어있는 성분들의 용출 시간이 길어지는 반면에, 추출온도가 높을 때에는 신갈나무 잎 성분 중 점액질이 다량 용출되어 여과되지 않아 추출 수율이 낮았다. 에탄올을 용매로 하여 추출한 경우는 물 추출보다 수율이 2~4% 정도로 높았으나 온도변화에 따른 추출 수율은 물 추출과 같이 60℃에서 가장 높았다. 메탄올 추출물의 경우, 추출온도가 60℃ 이상에서 수율이 13%로 가장 높았으며 물과 에탄올 추출물과는 달리 90℃에서도수율이 감소하거나 증가하지 않았다.
- coli 0157 :H7균 같은 그람음성균에 대해서는 물 또는 에탄올 추출물과 같은 결과를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 신갈나무의 추출용매에 따른 최소저해농도는 에탄올 추출물이 물과 메탄올 추출물보다 다양한 균종에 대해 더 강한 항균력을 나타내었으며, 특히 L. monocyto- genes 균에 대해서는 62.5~125μg/mL의 낮은 농도에서 최소저해농도를 나타내어 신갈나무 에탄올 추출물은 L. monocyto-genes균과 같은 세균성 식중독균에 대하여 매우 강한 항균력이 있음을 알 수 있었다. L.
- 또한 증가되는 경향을 나타내었다. 추출 용매별로는 에탄올 추출이 물 추출물이나 메탄올 추출보다 대체로 높은 항균활성을 나타내었으며 신갈나무 잎 에탄올 추출물은 60℃ 에서 추출한 경우 그람양성 세균에 대해 16~21 mm의 생육저해환을 나타내었고 그람음성 세균에 대해서는 13-17 mm의 생육저해환을 나타내었다.
- 추출용매 및 온도에 따른 항균력은 피검균에 따라 다소 차이는 있지만, 추출 온도별로는 60℃에서 추출시 3CTC와 90℃ 보다 항균력이 높게 나타나 추출 수율이 높을수록 항균 활성 또한 증가되는 경향을 나타내었다. 추출 용매별로는 에탄올 추출이 물 추출물이나 메탄올 추출보다 대체로 높은 항균활성을 나타내었으며 신갈나무 잎 에탄올 추출물은 60℃ 에서 추출한 경우 그람양성 세균에 대해 16~21 mm의 생육저해환을 나타내었고 그람음성 세균에 대해서는 13-17 mm의 생육저해환을 나타내었다.
- monocytogenes균에 특히 강한 항균력을 나타내었으며 같은 균이라도 균종에 따라 항균력의 차이가 났다. 특히, E. coli O157:H7균은 다른균에 비하여 현저하게 신갈나무 잎 물 추출물에 저항성을 나타내었으며 500|ig/mL이상의 농도에서도 항균력이 없었다. 반면에, S.
- monocytogenes ATCC 19111균에 대하여는 상승항균효과를 나타내었다. 한편, 각각의 sub-lethal 농도에서 E. coli 0157 : H7 0019균에 대한 신갈나무 잎 에탄올 추출물과 유기산들과의 병용처리시 두 물질간에는 상승효과는 없는 것으로 나타났다.
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