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문제 정의
- 대한 분석조건을 달리한 것이었으며 정량한계도 양호하지 못했다. 따라서, 본 연구에서는 우선 먼저 트리플루살과 HTB를 동시정량하여 생체시료분석에 응용 가능한 새로운 HPLC 동시분석조건을 확립하고자 하였다.
- 아울러, 본 연구에서는 흰쥐에게 경구와 정맥내 및 간문맥내로 트리플루살을 각각 투여하여 얻은 혈장중 약물농도추이와 그 주대사체인 HIB를 정맥내 투여하여 얻은 혈장중약물 농도추이를 약물 속도론적으로 해석함으로써 트리플 루살의 위장관내 및 간내 초회통과효과를 규명하고, 트리플루살의 HTB로의 대사에 미치는 위장관 및 간대사의 상대적인 기여도를 밝히고자 하였다.
가설 설정
- d)AUChtb is the area under the concentration-time curve of HTB after triflusal administration.
- 한편, 투여량 범위내에서는 트리플루살이나 HTB의 간내대사가 포화되지 않으며, 간내에서 트리플루살로부터 HTB 가 형성되는 속도(km)는 체순환혈로의 이행속도와 동일하다고 가정하여, 생체내에서 트리플루살이 대사받는 분율(Fm)과트리플루살이 HTB로 간내에서 대사받는 분율(Fmi) 및 대사속도(km,cal)를 다음 수식에 따라 구하였다12)
제안 방법
- 12시간 절식시킨 실험동물을 에테르로 가볍게 마취시킨 후왼쪽 대퇴부 동 • 정맥에 PE-50 폴리에틸렌관(Intramedic®, Clay Adams, Parsippany, NJ, 미국)을 삽입하였다. 간문맥내투여군에서는 간문맥에 25게이지 주사침이 장치된 폴리에틸렌관을 간문맥 혈류가 저해 받지 않도록 삽입하고 cyano- aaylate 접착제 (Aron-a®, Ibagasei Chemical Industry, Tokyo, 일본)를 사용하여 고정시킨 후 봉합견사를 사용하여 절개부위를 봉합하였다.
- 유기층(하층) 1 m/을 원심분리관에 옮기고 이를 원심분리형 농축기를 이용하여 25℃ 질소 가스하에서 증발•건조시키고 그 잔사를 100 μl의 이동상에 다시 녹인 후 50)μl를 취하여 HPLC system을 이용하여 분석하였다. 검량선은 트리플루살과 HTB의 표준액(각각 1,000μg/ml)을 각각 흰쥐 혈장으로 희석하여 트리플루살은 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0, 2.0 및 5.0|ig/mZ가 되도록, HTB의 경우에는 0.2, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0 및 200.0 μg/ml가 되도록 만든 후 상기 추출조건에 따라 추출하여 얻은 내부표준물질에 대한 시료물질의 피이크 높이비로서 작성하였으며 분석조건을 검정하기 위하여 일내 변동과 연속 3일간의 일간변동률(C.V. %) 및 이동상 약물농도를 기준으로 한 상대적추출률을 구하였다. 또한, 각 농도에서 10회 반복 측정하여 분석의 정확성을 평가하였다.
- 간문맥내투여군에서는 간문맥에 25게이지 주사침이 장치된 폴리에틸렌관을 간문맥 혈류가 저해 받지 않도록 삽입하고 cyano- aaylate 접착제 (Aron-a®, Ibagasei Chemical Industry, Tokyo, 일본)를 사용하여 고정시킨 후 봉합견사를 사용하여 절개부위를 봉합하였다. 그리고 체온은 직장온도 probe와 온도조절기 및 heating pad(CFP8285, Bioscience, Sheemess, Kent, 영국)를 통하여 전 실험기간동안 체온을 일정하게 유지하여 주었으며 마취에서 회복되었을 때 실험하였다. 약물투여는 트리플루살을 7.
- %) 및 이동상 약물농도를 기준으로 한 상대적추출률을 구하였다. 또한, 각 농도에서 10회 반복 측정하여 분석의 정확성을 평가하였다. 한편, 요중 및 담즙중 트리플루살과 HTB의 농도는 혈장중 농도 정량법에 따라 정량하였다.
- 4)에 녹여 kg당 10mg/2mZ의 용량으로 경구, 정맥내 및 간문맥내로 각각 투여한 후 일정시간 간격으로 대퇴동맥으로부터 혈액 약 300 μm를 취하고, 관속에 남아있는 혈액은 헤파린액(20IU/mZ>을 시용하여 동물체내에 밀어 넣었으며 실혈을 보상해 주기 위하여 동량의 생리식염수를 투여하였다. 마지막 채혈이 끝난 직후 방광내 요를 주사침을 통하여 뽑아내어 실험기간 동안 배설된 요와 합하여 배설된 요중 총배설량을 구하였으며 담즙은 약물투여 직후부터 최종 채혈시간까지 배설된 담즙중 총배설량을 구하였다. 채혈한 혈액은 곧바로 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 혈장 100μl를 취해서 정량할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
- 를 이용하여 결정하였다. 시간 0부터 ∞ 까지의 혈장중 약물농도-시간 곡선하 면적 (AUG)은 trapezoidal 방법에 따라 계산한 값과 최종 채혈시점의 혈장중 약물농도를 최종 소실상 기울기로 나누어 외삽하여 구한 값을 더하여 구하였으며10) 다른 약물속도론 파라미터 즉, 전신 혈장클리어런스(Cly), 혈장중 약물농도-시간 곡선하 면적 1차 모멘트(AUMC), 간내 및 위장관내 평균 체류시간(MRTh MRTg), 정상상태에서의 겉보기 분포용적(Vss), 요중 및 담즙중 미변화체 배설분율(fu와 fb), 경구투여후 생체이용률(Fpo), 간 초회통과효과(Fh)와 위장관 초회통과효과(Fg)를 다음 수식11)에 따라 구하였다.
- 약물투여 후 얻은 혈장중 트리플루살과 HTB의 농도는 WinNonHn 프로그램7)을 이용하여 초기치를 구한 후 가중치 1을 사용하여8)피팅하였으며 피팅의 적합도는 Akaike의 정보량 기준치(AIC)9)를 이용하여 결정하였다. 시간 0부터 ∞ 까지의 혈장중 약물농도-시간 곡선하 면적 (AUG)은 trapezoidal 방법에 따라 계산한 값과 최종 채혈시점의 혈장중 약물농도를 최종 소실상 기울기로 나누어 외삽하여 구한 값을 더하여 구하였으며10) 다른 약물속도론 파라미터 즉, 전신 혈장클리어런스(Cly), 혈장중 약물농도-시간 곡선하 면적 1차 모멘트(AUMC), 간내 및 위장관내 평균 체류시간(MRTh MRTg), 정상상태에서의 겉보기 분포용적(Vss), 요중 및 담즙중 미변화체 배설분율(fu와 fb), 경구투여후 생체이용률(Fpo), 간 초회통과효과(Fh)와 위장관 초회통과효과(Fg)를 다음 수식11)에 따라 구하였다.
- 그리고 체온은 직장온도 probe와 온도조절기 및 heating pad(CFP8285, Bioscience, Sheemess, Kent, 영국)를 통하여 전 실험기간동안 체온을 일정하게 유지하여 주었으며 마취에서 회복되었을 때 실험하였다. 약물투여는 트리플루살을 7.2 mM NaHCO3 용액 (pH 7.4)에 녹여 kg당 10mg/2mZ의 용량으로 경구, 정맥내 및 간문맥내로 각각 투여한 후 일정시간 간격으로 대퇴동맥으로부터 혈액 약 300 μm를 취하고, 관속에 남아있는 혈액은 헤파린액(20IU/mZ>을 시용하여 동물체내에 밀어 넣었으며 실혈을 보상해 주기 위하여 동량의 생리식염수를 투여하였다. 마지막 채혈이 끝난 직후 방광내 요를 주사침을 통하여 뽑아내어 실험기간 동안 배설된 요와 합하여 배설된 요중 총배설량을 구하였으며 담즙은 약물투여 직후부터 최종 채혈시간까지 배설된 담즙중 총배설량을 구하였다.
- 5 ml를 넣고 정확히 3분간 vortexing 한 후 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 유기층(하층) 1 m/을 원심분리관에 옮기고 이를 원심분리형 농축기를 이용하여 25℃ 질소 가스하에서 증발•건조시키고 그 잔사를 100 μl의 이동상에 다시 녹인 후 50)μl를 취하여 HPLC system을 이용하여 분석하였다. 검량선은 트리플루살과 HTB의 표준액(각각 1,000μg/ml)을 각각 흰쥐 혈장으로 희석하여 트리플루살은 0.
- 혈장중 트리플루살과 HTB의 함량을 동시정량하기 위하여 이미 보고된 살리실산의 HPLC 분석법6)을 다소 수정하여 Table I의 조건에 따라 측정하였으며 내부표준물질로서 푸로세미드를 이용한 시료의 추출조건은 다음과 같다. 혈장 0.
- 흰쥐에 트리플루살과 HTB를 각각 정맥내 투여(10 ㎎/㎏) 하고 트리플루살을 경구 및 간문맥내로 따로 투여(10 ㎎/㎏)하여 얻은 혈장중, 담즙중 및 요중 트리플루살과 HTB의 농도를 HPLC를 이용하여 동시정량하고 약물속도론적으로 검토한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 45 μm-membrane filter로 여과하여 사용하였다. 기기로는 원심분리형 농축기(CVE-200D, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, 일본), 원심분리기(UNION 55R, Harnl Science Industrial Co., 인천, 대한민국), 초저온냉동고(DF8514, 일신랩, 서울, 대한민국), 탁상용 혼합기(G560, Scientific Co., Bohemia, NY, 미국) 등을 사용하였고 HPLC systeme 펌프 (LC-lOADvp, Shimadzu, Tokyo, 일본), SPHERI-10 RP18 컬럼 (100X4.6 mm, 입자경 10 μm, AUtech, 미국), UV-VIS 검출기(SPD-10A, Shimadzu, Tokyo, 일본), 주입기(Model 7725, Rheodyne, Cotati, CA, 미국), 적분계 (Model Class- VB Shimadzu, Tbkyo, 일본)를 사용하였다.
- 대한실험동물센터에서 분양 받은 6주령의 Sprague-Dawley (S.D.)계 웅성 흰쥐를 물과 사료를 자유로이 공급하여 1주간동일 조건(20~25℃, 50- 60% RH, 조명은 12시간 명암주기)에서 사육한 후 체중 200~300 g에 해당한 것을 사용하였으며 실험중에는 사료와 물을 공급하지 않았다.
- 트리플루살(하나제약, 서울, 대한민국), 2-hydroxy-4-trifluoromethyl benzoic acid(J. Uriach & Cia Research Center, Barcelona, 스페인), 푸로세미드(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 미국, Figure 1), HPLC용 아세토니트릴, 메탄올(이상 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, 미국), 85% ortho-phosphoric acid(Fluka Chemie AG., Bushs, 스위스), 생리식염수 및 헤파린(이상 중외제약, 서울, 대한민국)등을 사용하였으며, 증류수는 Milli Q(Millipore Co., Milford, MA, 미국)에서 18MQcm로 통과시킨 것을 실험에 사용하였고 클로로포름, 염산 및 기타 시약들은 특급 및 1 급 시약들을 그대로 사용하였다. 그리고, 이동상의 구성성분들은 0.
데이터처리
- All parameters were calculated by statistical moment analysis.
- )로 표시하였으며, CLT와 Vss는산술평균 대신 조화평균값13)을 사용하였다. 각 군간의 차이에 관한 검정은 Student의 unpaired t-test에서 p<0.05인 경우만을 유의성이있다고 판정하였다.
- 전신 혈장클리어런스(CLT)와 정상상태에서의 겉보기 분포용적 (Vss)을 제외한 모든 측정치와 계산치는 산술평균±표준편차(S.D.)로 표시하였으며, CLT와 Vss는산술평균 대신 조화평균값13)을 사용하였다. 각 군간의 차이에 관한 검정은 Student의 unpaired t-test에서 p<0.
이론/모형
- 또한, 각 농도에서 10회 반복 측정하여 분석의 정확성을 평가하였다. 한편, 요중 및 담즙중 트리플루살과 HTB의 농도는 혈장중 농도 정량법에 따라 정량하였다.
성능/효과
- 1. 제시된 트리플루살과 HTB의 HPLC 동시 분석법은 그 추출율이 트리플루살은 95.7±2.3%, HTB는 96.5±4.3%이었고, 정량한계가 트리플루살은 0.02 μg/ml, HTB는 0.1 μg/ml이었으며 그 변동성이나 정확성을 나타내는 편차도 모두 10% 미만으로 나타났을 뿐만 아니라 흰쥐의 혈장, 요 및 담즙 중 구성성분과도 간섭현상이 없이 잘 분리되었다. 이로부터 본 동시정량법은 트리플루살과 HTB의 대사동태를 연구하기에 충분한 감도와 재현성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 또한 혈액계 부작용, 위장장해, 출혈 위험 등의 부작용이 적기 때문에 뇌혈관장애, 협심증, 동맥경화증, 수술후 혈전증, 당뇨병성 말초혈관 질환에 널리 사용되고 있다.12) 트리플루살은 경구투여시 그 생체이용율이 높게 나타나며 체내 주대사체인 2-hydroxy-4-trifluoromethyl benzoic acid (HTB, Figure 1)는 트리플루살보다도 강한 약리활성을 나타내는데, 트리플루살을 사람에게 경구 투여하였을 때 최고 혈청중 농도에 도달하는 시간은 약 40분 이내이며 반감기는 약 0.53시간이고 그 주 대사체인 HTB의 반감기는 약 34.3시간으로 보고되어 있다.3,4) 또한, 트리플루살은 in vitro에서도 거의 대부분이 가수분해되어 활성대사체인 HTB로 변환되는데 트리플루살을 흰쥐에 투여할 경우 혈장중 트리플루살 농도는 매우 낮고 변환된 HTB가 2.
- 2. 요 및 담즙중으로 배설된 트리플루살의 총 배설량이 각각 투여량의 1% 미만인 것으로부터 트리플루살은 체내에서 거의 모두 대사를 받아 HTB로 변화하고 있음을 알 수 있었다.
- 3. 경구투여된 트리플루살은 위장관에서 약 5%만이 대사되고 간에서 약 53% 대사받아 경구투여시 트리플루살의 생체이용률은 약 44%가 됨을 알 수 있었으며 간으로 귀속된 트리플루살이 HTB로 대사받는 분율(Fmi)은 약 98%로 간으로 귀속된 트리플루살은 거의 모두 HTB로 변환하고 그 변환속도(Km,cal)도 매우 커 그 반감기가 약 0.1 시간으로 이는 트리플루살의 생체내 소실반감기인 약 0.1 시간과 거의 일치함을 알 수 있었다. 이는 트리플루살의 생체내 소실속도는 결국 트리플루살로부터 HTB가 생성되는 속도를 반영하고 있음을 시사하고 있다.
- 이는 트리플루살의 생체내 소실속도는 결국 트리플루살로부터 HTB가 생성되는 속도를 반영하고 있음을 시사하고 있다. 그렇지만, 트리플루살은 위장관이나 간 이외의 조직과 장기에서도 대사받을 가능성이 크고 혈장중에 존재하는 에스테라제에 의해서도 HTB로 대사받을 가능성이 있으므로 이러한 in vitro와 in vivo에서의 트리플루살의 HTB로의 대사동태를 종합적으로 표현할 수 있는 대사동태 모델을 수립할 필요가 있음을 알 수 있었다.
- 6% 이하였다. 그리고, 이동상에 녹인각 약물의 피크 높이에 대하여 동일 농도의 혈장 추출물의 피이크 높이로부터 구한 상대적 추출 회수율은 트리플루살인 경우 95.7±2.3%, HTB인 경우 96.5±4.3%로 나타났으며 두 약물 모두 각 농도에서 10회 반복 측정하여 얻은 표준편차(% deviation)도 모두 10% 미만으로 나타났다. 한편, 요 및 담즙에 대한 트리플루살과 HTB의 정량 결과는 모두 혈장에 대한 정량 결과의 실험 오차 범위내에 존재하였다.
- 1 pg/mZ이었다. 내부표준물질의 피크 높이에 대한 트리플루살과 HTB의 피크 높이비로 구한 트리플루살과 HTB의 검량선은 각각 피크 높이베 = 0.2677X농도 + 0.0146(r = 0.99, p<0.01) 및 피크 높이비 =0.3954X농도 + 0.7706(r = 0.99, p< 0.01)2- 각각의 혈장중 농도범위에서 양호한 직선성을 나타내었으며 이들 농도범위에서 트리플루살의 일내 변동계수(C.V. %)는 9.6% 이호I, 일간변동계수는 10.8% 이하였고, HTB의 일내변동계수(C.V %)는 9.5% 이하, 일간변동계수는 9.6% 이하였다. 그리고, 이동상에 녹인각 약물의 피크 높이에 대하여 동일 농도의 혈장 추출물의 피이크 높이로부터 구한 상대적 추출 회수율은 트리플루살인 경우 95.
- 113시간의 약 31%를 차지하는 매우 중요한 장기가 됨을알 수 있었다(Table IV). 또한, 이렇게 간으로 귀속된 트리플루살이 HTB로 대사받는 분율(Fmi)은 약 98%로 간으로 귀속된 트리플루살은 거의 모두 HTB로 변환하고 그 변환속도(Km,cal)도 매우 커 그 반감기가 약 0.1 시간으로 이는 트리플루살의 생체내 소실반감기인 약 0.1 시간과 거의 일치함을 알 수 있었다(Table IV). 이는 트리플루살의 생체내 소실속도는 결국 트리플루살로부터 HTB가 생성되는 속도를 반영하고 있음을 시사하고 있다.
- 035시간으로 간 초회통과효과 즉, 간 통과율은 약 47%로 경구투여된 트리플루살은 위장관에서 약 5%만이 대사되고 간에서 약 53% 대사받아 경구투여시 트리플루살의 생체이용률은 약 44%가 됨을 알 수 있었다(Eble IV). 아울러, 트리플루살의 간내 체류시간(MRTh)은 약 0.035시간으로 간은 정맥투여시 트리플루살의 체내 총 체류시간(MRI)인 약 0.113시간의 약 31%를 차지하는 매우 중요한 장기가 됨을알 수 있었다(Table IV). 또한, 이렇게 간으로 귀속된 트리플루살이 HTB로 대사받는 분율(Fmi)은 약 98%로 간으로 귀속된 트리플루살은 거의 모두 HTB로 변환하고 그 변환속도(Km,cal)도 매우 커 그 반감기가 약 0.
- 1 μg/ml이었으며 그 변동성이나 정확성을 나타내는 편차도 모두 10% 미만으로 나타났을 뿐만 아니라 흰쥐의 혈장, 요 및 담즙 중 구성성분과도 간섭현상이 없이 잘 분리되었다. 이로부터 본 동시정량법은 트리플루살과 HTB의 대사동태를 연구하기에 충분한 감도와 재현성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 한편, 요 및 담즙에 대한 트리플루살과 HTB의 정량 결과는 모두 혈장에 대한 정량 결과의 실험 오차 범위내에 존재하였다. 이로부터 트리플루살과 HTB에 대한 상기 HPLC 동시 분석법은 흰쥐의 혈장, 요 및 담즙을 이용하여 트리플루살의 대사동태를 연구하기에 충분한 감도와 재현성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 트리플루살은 대퇴정맥내, 간문맥내 및 경구 투여경로와 무관하게 그 담즙중 및 요중 배설분율伍, 및 九)이 모두 1% 미만으로 체내에서 모두 대사되어 소실됨을 알 수 있었으며 투여경로와 무관하게 그 생체내 소실반감기(山2)는 약 이 시간으로 매우 짧고 그 전신 혈장클리어런스(。分)는 매우 크게 나타남을 알 수 있었다(Table II). 이에 반하여 트리플루살로부터 생성된 주 활성대사체인 HTB나 외부로부터 정맥투여된 HTB는 그 생체내 소실반감기S/2)가 약 24.
- 한편, 트리플루살의 위장관 통과 체류시간은 약 0.01 시간으로 매우 짧고 그 통과율은 약 95%이며 간내 체류시간은 약 0.035시간으로 간 초회통과효과 즉, 간 통과율은 약 47%로 경구투여된 트리플루살은 위장관에서 약 5%만이 대사되고 간에서 약 53% 대사받아 경구투여시 트리플루살의 생체이용률은 약 44%가 됨을 알 수 있었다(Eble IV). 아울러, 트리플루살의 간내 체류시간(MRTh)은 약 0.
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