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문제 정의
- 본 연구에서는 Candida albicans와 Trichophyton meniagrophytes 등과 같은 인체 질병 원인 진균들에 대한 polyP의항 진균 효과를 검정하고, 식품 첨가물로서의 polyP의 항진균 기능의 가능성과 병원성 진균에 대한 임상적 '이용 가능성을 검토함에 있어서, 그 작용기작에 대한 기초적인 자료를 제공하고자 수행하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- Lactoferrin의 진균 성장 억제실험은 human lactoferrin을 100, 200, 400, 800 /zg/mZ을 malt extract broth와 SDA에 위와 동일한 방법으로 첨가하고 C. albicans는 흡광도를, T. mentagrophytese: 균사체 집락성장 길이를 측정하였다. PolyP 와 human lactoferrin의 공동작용 효과를 관찰하기 위하여 polyP 75를 400 ㎍/ml 농도 첨가한 배지에 human lactoferrin 800 ㎍을 첨가한 malt extract와 SDA 배지에서 배양한 균주들과 polyP 75 및 human lactoferrin을 각각 첨가한 대조군과의 균 성장 속도를 위의방법으로 측정하여 비교하였다.
- 2 정도 되게 희석조절하여 각 well에 접종하였다. PolyP type들의 진균 성장억제 비교실험은 각각의 polyP와 pyrophosphate를 m/당 200, 400, 600㎍ 농도로 0.22 ㎛ 주사필터를 사용하여 무균적으로 배지에 첨가하고 25℃에서 18시간 배양한 배양액과 polyl를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 540 nm에서 측정 비교하였다. T.
- mentagrophytese: 균사체 집락성장 길이를 측정하였다. PolyP 와 human lactoferrin의 공동작용 효과를 관찰하기 위하여 polyP 75를 400 ㎍/ml 농도 첨가한 배지에 human lactoferrin 800 ㎍을 첨가한 malt extract와 SDA 배지에서 배양한 균주들과 polyP 75 및 human lactoferrin을 각각 첨가한 대조군과의 균 성장 속도를 위의방법으로 측정하여 비교하였다.
- PolyP가 세포막이나 세포벽에 영향을 주어 세포내의 핵산이 유리 되는지를 관찰하기 위하여 C. albicans 균주를 malt extract bro th에 25℃ 에서 18시간 배양한 다음 10, 000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균을 회수한후 균의 농도가 최종흡광도 0.8이 되게 5 m/ 0.15 M NaCl에 현탁 시킨 후 polyP 15와 polyP 75(600 ㎍/ml)를 각각 첨가시킨 현탁액을 30ipm에서 실온 회전 진탕배양하였다. 배양후 30분, 60분, 120분 180분 간격으로 Im/을 취하여 10, 000rpm에 15분간 원심분리한 후에 상층액을 취하여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
- PolyP의 성장억제 효과가 chelation 효과에 의한 것인지를 관찰하기 위하여 배지에 polyP 75와 함께 CaCL와 Mg Cl을 첨가한 배지에서의 polyP의 성장억제 효과의 영향을 보았다. polyP 75의 성장억제 효과는 CaCl과 MgCL을 첨가하면 실험균주 모두에서 감소흐)는경향을 나타내었다(Figs.
- PolyP의 첨가로 인한 진균 세포막이나 세포벽의 구조변화에 따른 세포형태 변화를 관찰하기 위하여 polyP 75 (400㎍/ml)를 첨가한 배지에서 48시간 배양한 C. albicans 세포를 광학 현미경으로 세포 형태의 변화를 관찰 하였다. Propidium iodide을 이용한 세포 투과성 실험은 위의 조건에서 polyP 75(400를 첨가한 배지에서 배양한 세포를 윈심분리하여 수거한 후, slide 잉ass 위에 도말한 세포들을 0.
- albicans 세포를 광학 현미경으로 세포 형태의 변화를 관찰 하였다. Propidium iodide을 이용한 세포 투과성 실험은 위의 조건에서 polyP 75(400를 첨가한 배지에서 배양한 세포를 윈심분리하여 수거한 후, slide 잉ass 위에 도말한 세포들을 0.18 M Tris-Cl용액에 녹인 propidium iodide(80㎍/ml)와 멸균된 05% RNase 염색액으로 처리하여 24 시간 동안 humid chamber에서 차광하여 반응시킨후 형광 현미경으로 100배에서 관찰 하였다.
- albicans를 25℃에서 18시간 배양후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. T. mentagmphytes는 동일 농도의 polyP 75를 첨가한 SDA 배지에 접종한 agar block 균사를 25℃에서 6일간 배양후 균사체 집락 성장 길이를 측정하였다.
- 22 ㎛ 주사필터를 사용하여 무균적으로 배지에 첨가하고 25℃에서 18시간 배양한 배양액과 polyl를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 540 nm에서 측정 비교하였다. T. mentagrophytes와 같은 균 사형 균주는 성장하고 있는 균사체 끝부분에서 직경 5 mm 정도의 agar block을 취하여 위의 액체배지와 동일한 농도의 polyP 및 pyrophosphate를 첨가한 SDA 배지에 접종하여, 25℃에서 6일간 배양한후 관찰하였다. 진균 성장 억제 효과는 무처리 대조군과의 균사체 집락 성장 길이(지름)를 측정하여 비교하였다.
- 15 M NaCl에 현탁 시킨 후 polyP 15와 polyP 75(600 ㎍/ml)를 각각 첨가시킨 현탁액을 30ipm에서 실온 회전 진탕배양하였다. 배양후 30분, 60분, 120분 180분 간격으로 Im/을 취하여 10, 000rpm에 15분간 원심분리한 후에 상층액을 취하여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
- albicans와 같이 액체 배지에서 효모형으로 성장하는 균주는 malt extract broth배지에 접종하여 25℃에서 18시간 진탕 배양한(60rpm) 배양액을 성장 억제 실험을 위한 접종 균으로 사용하였다. 세포배양용 &well plate에 malt extract broth를 각 well에 2mZ씩 첨가흐]고 접종균주액의농도를 분광광도계(540nm상에서 최종흡광도 0.2 정도 되게 희석조절하여 각 well에 접종하였다. PolyP type들의 진균 성장억제 비교실험은 각각의 polyP와 pyrophosphate를 m/당 200, 400, 600㎍ 농도로 0.
- T. mentagrophytes 경우는 polyP 75를 400 /zg/mZ 첨가한 SDA 배지에 CaCq과 MgCl?을 각각 20mM 첨가한 후, 직경 5 mm 정도의 성장균사 block 을 접종하여 25℃에서 6일간 배양한후에 균사성장을 관찰하였다.
- mentagrophytes와 같은 균 사형 균주는 성장하고 있는 균사체 끝부분에서 직경 5 mm 정도의 agar block을 취하여 위의 액체배지와 동일한 농도의 polyP 및 pyrophosphate를 첨가한 SDA 배지에 접종하여, 25℃에서 6일간 배양한후 관찰하였다. 진균 성장 억제 효과는 무처리 대조군과의 균사체 집락 성장 길이(지름)를 측정하여 비교하였다.
- 진균 성장억제가 가장 우수한 polyP 75의 성장억제 농도 범위를 정하기 위하여 mZ당 800, 600, 400, 200, 100㎍/ml 농도의 polyl를 무균 첨가한 malt extract broth 배지에 최종농도 흡광도 0.2 되게 접종한 C. albicans를 25℃에서 18시간 배양후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. T.
대상 데이터
- C. albicans와 같이 액체 배지에서 효모형으로 성장하는 균주는 malt extract broth배지에 접종하여 25℃에서 18시간 진탕 배양한(60rpm) 배양액을 성장 억제 실험을 위한 접종 균으로 사용하였다. 세포배양용 &well plate에 malt extract broth를 각 well에 2mZ씩 첨가흐]고 접종균주액의농도를 분광광도계(540nm상에서 최종흡광도 0.
- 균주는 SDA(sabouraud dextrose agar) 배지에 접종하여 25℃에서 배양흐}였다. Polyphosphate는 Sigma사에서 구입한 sodium phosphate glasses type 15(average chain length 15), type 45, type 75를.각각 증류수에 녹여서 사용하였으며 human lactoferrine Sigma사 제품을 사용하였다.
- Polyphosphate는 Sigma사에서 구입한 sodium phosphate glasses type 15(average chain length 15), type 45, type 75를.각각 증류수에 녹여서 사용하였으며 human lactoferrine Sigma사 제품을 사용하였다.
- 본 실험에서는 생명공학연구소 유전자 은행으로부터 구입한 Candida albicans(KCTC 7965), Trichophyton ment-agrophytesgbC 6077) 등을 실험 균주로 사용하였다. 균주는 SDA(sabouraud dextrose agar) 배지에 접종하여 25℃에서 배양흐}였다.
성능/효과
- C. albicans와 같은 효 모성 진균에서는 polyP 75가 polyP 45와 polyP 15에 비하여 polyP의 농도가 40%ug/m/인 경우에 각각 78, 39%의중가된 성장억제 효과를 보였으며, T mentagrophytes 에서 도 polyP 75가 poly 15와 poly 45에 비하여 증가된 성장억제 효과를 보였다. 반면 pyrophosphate는 두 균주 모두에 대하여 성장 억제를 나타내지 않았다(Figs.
- mentagrophytes 균주에 대하여 성장억제 효과를 나타냈다. Phosphate의 사슬길이가 다른 3가지 type의 polyP의 진균 성장억제 효과를 비교한 결과 사슬길이가 가장 긴polyP 75가 실험한 균주들에서 가장 좋은 성장 억제 효과를 나타내었으며 사슬길이가 짧아질수록 억제효과 능력이 감소하는 것으로 나타났다(Figs. 1, 2).
- Polyl를 48시간 처리한 C. albican 배양액을 광학현미경으로 관찰한 결과 다수의 효모 세포들의 swelling 현상이 관찰 되었다(Fig. 7). 그러나 무처리 군의 배양액에서는 세포 형태의 변화가 관찰되지 않았다.
- mentagrophyteseX polyP에 매우 감수성이 크다는 것을 보여주었다. T. mentagrophytese: 완전 성장억제 농도가 800㎍/ml으로 나타나 600㎍/ml 농도에서 완전 성장억제를 보인 C. albican에 비해서 감수성이 약한 것으로 나타났다.
- polyP 75의 성장억제 효과는 CaCl과 MgCL을 첨가하면 실험균주 모두에서 감소흐)는경향을 나타내었다(Figs. 5, 6).Jen 등(1986)은 Mg2+을 첨가한 배지에서는 polypho-sphate S.
- 보고하였다. 본 실험결과에서 human lactoferrin을 10~200 ㎍/ml의 농도에서 실험을 한 결과 모든 균주들에 대하여 진균 성장억제 현상이 나타나지 않았다. Xu가 실행한 실험에서는 150 분 동안의 배양시간에서 lactoferrin의 진균억제작용을 관찰하였는데 150분의 배양시간은 성장억제효과를 측정하기에는 너무 단시간이라 생각되며 본 실험에서 lactoferrin 첨가 6, 12, 24시간 후의 성장억제효과를 측정한 결과 lactoferrin의 진균성장억제 효과는 관찰되지 않았다(data not shown).
- 본 실험에서 사용한 모든 종류의 'polyP는 C. albicanse T. mentagrophytes 균주에 대하여 성장억제 효과를 나타냈다. Phosphate의 사슬길이가 다른 3가지 type의 polyP의 진균 성장억제 효과를 비교한 결과 사슬길이가 가장 긴polyP 75가 실험한 균주들에서 가장 좋은 성장 억제 효과를 나타내었으며 사슬길이가 짧아질수록 억제효과 능력이 감소하는 것으로 나타났다(Figs.
- 본 실험에서는 Knabel 실험보다 phosphate 사슬길이가 더욱긴 polyphosphate를 사용한 결과 사슬길이가 가장 긴 polyP 75에서 성장억제가 가장 크게 나타났다. 이러한 결과는 Sofos 등(1986)의 결과와 일치하며, 진균 세포벽은 chitin이나 chitosan 등의 음전하성 polymer를 함유하여 세포벽 안전성 유지에 필요한 양이온을 부착시킨다고 보고되었는 데 (Ross, 1986), Knabel 등(1991)은 polyP에 의한 세포벽으로 부터의 양 이온의 제거가 세포벽의 안정성을저하시켜 진균 성장을 억제하는 것으로 추측하였다.
- flavuss의 경우 Mg2+ 첨가는 tripolyphosphate 성장억제를 회복시켰으나, sodium hexametaphosphate에 대하여는 성장억제 감소를 못 시키는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 MgCl2가 CaCl2 보다 성장억제 효과 감소가 큰 것으로 나타났는데 이러한 결과는 세균에서의 Jen 등(1986)의 결과와 일치하였으며, 이러한 결과는 Irani 등(1963) 이 보고한 바에 의하면 Mg2+ 이온은 다른 양이온 비하여 polyP와 높은 안정성을 유지한다는 사실과 관련이 있다고 사려된다.
- Lactoferrin도 세포막이나 벽에 존재하는 양이온 특히 Fe"를 흡착하여 세균 성장을 억제하는 것으로 알려져 있는데 아직 까지 lactoferrin의 항진균에 대한 보고는 미비한 편이다. 본 실험의 결과로는 세균과는 달리 효 모성 진균 및 균사체 성장 진균에게 lactoferrine 억제효과가 없는 것으로 볼 때 이는 세균과. 진균의 세포벽이나 막에서의 Fe2+에 대한 구조기능상의 차이에 기인한 것이라고 사려되며 lactoferrin의 진균 성장에 미치는 영향에 대하여는 더 많은 진균류에 대한 연구가 진행되어야 lactoferrin에 대한 효과가 검증될 수 있다고 생각한다.
- 본 실험의 진균들에서 보여준 성징억제 효과는 농도환산을 하여 비교하였을때, Listeria의 세균에서보고된 0.5% 의 성장억제 농도와 mutant Sfrepfococcs에서 보고된 약 0.1-0.2% 농도 보다 낮은농도에서 성장억제를 나타내었는데 이는 C. albicans와 T. mentagrophyteseX polyP에 매우 감수성이 크다는 것을 보여주었다. T.
- 성장억제 효과가 가장 좋은 polyP 75를 사용하여 농도별 성장억제 효과를 측정한 결과 각 균주의 종류에 따라 성장억제농도는 다르지만 100㎍/ml에서 800㎍/ml 범위에서 성장억제의 효과를 보였으며, 800 ㎍/ml 이 싱의 농도에서는 균주들에 대하여 완전한 성장억제를 나타내였다(Figs. 3, 4).
- 그러나 무처리 군의 배양액에서는 세포 형태의 변화가 관찰되지 않았다. 세포막이나 벽의 견고성 및 투과성 변화를 관찰하는데 사용되는 propidium iodide 처리 실험 결과, 세포막 불투과성 물질인 propidium iodide 가 polyP를 처리한 세포에서는 세포막을 투과하여 세포 내로 유입되어 염색체와 결합하여 형광 발현을 나타내었다 (Fig. 8). 이러한 결과로 볼때 polyl를 처리한 세포의 swelling이나 propidium iodide의 막 투과현상들은 polyP가 세포막이나 벽의 구조에 변화를 야기시켜 일어나는 현상으로 사려된다.
- 이러한 결과는 Sofos 등(1986)의 결과와 일치하며, 진균 세포벽은 chitin이나 chitosan 등의 음전하성 polymer를 함유하여 세포벽 안전성 유지에 필요한 양이온을 부착시킨다고 보고되었는 데 (Ross, 1986), Knabel 등(1991)은 polyP에 의한 세포벽으로 부터의 양 이온의 제거가 세포벽의 안정성을저하시켜 진균 성장을 억제하는 것으로 추측하였다. 이러한 점에서 본 실험에서 사슬길이가 긴 polyP tgpe이 더 높은 성장억제 효과를 보이는 결과는 polyP의 양이온에 대한 chelation효과를 고려할 때 짧은길이의 polyP는 긴 사슬 polyP에 비하여 상대적으로 양이온과의 결합부위가 적으므로 항균효과가 적은 것으로 사려된다. 그러나 Knabel 등 (1991)의 결과를 보면, sodium triphosphate가 sodium hexametaphosphate 보다 성장억제가 큰 것으로 나타나 polyP 의 길이에 따른 chelation결합 부위의 효과에 대하여는 더 자세한 연구가 필요할것이다.
- 이상의 결과로 볼 때 polyP는 진균 성장에 대하여 억제 효과가 높다는 사실과 더불어, 진균의 세포벽이나 세포막의 구조변화를 야기시키는 것을 보여주었는데, 이는 핵산 유리의 관찰이나, 양이온의 첨가가 polyP의 항진균 작용에 미치는 영향을 고려할 때 polyP의 진균 성장억제는 polyP 의 양이온에 대한 chelation 효과에 기인하는 기작으로 보는 것이 합당하다고 사려된다. 따라서 식품첨가물로서의 polyP는 식품의 여러가지 성질을 유지시켜주는 기능 이외에도 식품의 진균 오염 억제 기능도 있을 것이라 사려된다.
- albicans 에서의 세포막 파괴에 의하여 유리된 핵산량을 측정한 결과, chitosan 처리 1시간 이내에서 가장 많은 핵산 관련 물질의 유출을 보고하였는데 핵산 유리 시간의 이와 같은 차이는 세포막에 영향을 주는 물질의 종류에 따라 다른 양상을 보이는것이라 추정된다. 한편 본 실험의 결과 polyP type에 따른 핵산유리 정도의 차이는 나타나지 않는 것으로 관찰되었다(data not shown).
후속연구
- gingivalis 에서 polyP에 의한 세포막이나 세포벽 구조에 대한 변화를 전자현미경으로 관찰하여 보고하였다. PolyP 처리에 의한 세포 형태 변화 기작이 진균 세포막에 어떠한 영향을 주는지 혹은 세포벽 구조에도 영향을 주는지를 더 자세히 알아보기 위하여는 세포막이나 세포벽의 전자현미경 관찰을 해야 할 것으로 생각한다.
- 이러한 점에서 본 실험에서 사슬길이가 긴 polyP tgpe이 더 높은 성장억제 효과를 보이는 결과는 polyP의 양이온에 대한 chelation효과를 고려할 때 짧은길이의 polyP는 긴 사슬 polyP에 비하여 상대적으로 양이온과의 결합부위가 적으므로 항균효과가 적은 것으로 사려된다. 그러나 Knabel 등 (1991)의 결과를 보면, sodium triphosphate가 sodium hexametaphosphate 보다 성장억제가 큰 것으로 나타나 polyP 의 길이에 따른 chelation결합 부위의 효과에 대하여는 더 자세한 연구가 필요할것이다.
- 본 실험의 결과로는 세균과는 달리 효 모성 진균 및 균사체 성장 진균에게 lactoferrine 억제효과가 없는 것으로 볼 때 이는 세균과. 진균의 세포벽이나 막에서의 Fe2+에 대한 구조기능상의 차이에 기인한 것이라고 사려되며 lactoferrin의 진균 성장에 미치는 영향에 대하여는 더 많은 진균류에 대한 연구가 진행되어야 lactoferrin에 대한 효과가 검증될 수 있다고 생각한다.
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