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문제 정의
- 본 연구에서는 사람의 유방암 세포인 MCF-7 세포주를 대상으로 hGSTKl 유전자의 발현 정도와 방사선 조사에 의한 hGSTKl 유전자의 발현 변화를 관찰하고 hGSTKl 유전자를 과발현시킴으로써 hGSTKl이 방사선 감수성에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다.
제안 방법
- hGSTKl 및 pcDNA3.1/Myc-His(+)를 결합시키기 위하여 제한효소로 처리한 hGSTKl 유전자 30 ftnol, pcDNA3.1/Myc- His(+) vector 10 fmol, 1 U/"l T4 ligase 1 “1, 2XT4 rapid Ugase 완충액[250 mM Tris-HQ (pH 7.6), 50 mM MgC12, 5 mM ATP, 5 mM dithiothreitol, 25% polyethylene glycol 8000] 5 “1 를 넣고 증류수로 전체 부피를 10 M로 맞춘 다음 25℃ 에서 씨간 반응시켰다.
- hGSTKl이 이입된 세포와 hGSTKl이 이입되지 않은 MCF- 7세포를 수확한 후 5X105개의 MCF-7 세포를 직경 100 mm 배양 접시에 분주하였다. 2 Gy 및 8 Gy의 엑스선을 비분할 조사하거나, 4 Gy 조사 후 4시간 후 다시 4 Gy를 분할조사 하였다 엑스선 조사 후 3, 6, 12, 24, 48시간에 세포를 취하여 RNAwiz and Superscript U (Ambion사, 미국)를 사용하여 RT-PCR을 시행하였다. RT-PCR에 사용된 pHmer는 다음과 같으며, 대조군으로 GAPDH를 사용하였다.
- T7 quick master mix 40 以 35S-methiomne (1000 Ci/mmol) 2 “1, DNA 5 “g을 시험관에 넣고, 증류수를 첨가하여 전체 부피 50 M로 조정하였다. 3(TC에서 1시간 반응시킨 후, SDS-PAGE를 시행하였다 전기 영동을 마친 gel을 -70℃에서 24시간 엑스선 필름에 노출시킨 후 현상하여 합성된 단백질을 확인하였다. 염기서열로 계산한 단백질의 분자량인 28.
- hGSTKl이 이입된 세포와 hGSTKlo] 이입되지 않은 MCF- 7세포들을 trypsin-EDTA 처리하여 수확한 후, 세포수를 측정하였다. 5X1O5개의 MCF-7 세포를 10 ml DMEM 배양액이든 직경 100 mm 배양접시에 접종하였다. 엑스선 조사는 6 MV 선형가속기를 이용하였다.
- 5 X 106개의 세포를 분주한 후 항생제 및 혈청이 첨가된 DMEM 배양액 4 ml를 첨가하였다. DMEM 배양액 100 “1에 DNA 1, 2, 5을 각각 넣고 10 “1의 Superfect transfection ient를 첨가하여 섞어주고 10분간 방치한 후 항생제 및 혈청이 첨가된 DMEM 배양액 1 ml를 첨가하여 섞어주었다. 혼합용액을 분주하여 가볍게 섞어주고 370, 5% COM] 3시간 동안 배양하였다.
- EcoRI 제한효소 및 Xhol 제한효소를 이용하여 hGSTKl 유전자 및 pcDNA3.1/Myc-His(+) vector의 재단을 시행하였다. Phenol extraction method를 이용하여 제한효소에 의한 반응을 마친 각각의 DNA를 추출하였다.
- TNT T7 quick coupled transcription/translatian system (Pro mega사, 미국)을 이용하여, 결합된 pcDNA3.1/hGSTKl/Myc-His (+) DNA를 MCF-7 세포주에 이 입시키기 전에 시험관 내에서 단백질 힙성이 유도되는지 확인하였다. T7 quick master mix 40 以 35S-methiomne (1000 Ci/mmol) 2 “1, DNA 5 “g을 시험관에 넣고, 증류수를 첨가하여 전체 부피 50 M로 조정하였다.
- 1). Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega사, 미국)을 이용하여 PCR로 증폭시킨 DNA를 정제 하였다.
- Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system을 이용하여 E. coli로부터 pcDNA3.1/hGSTKl/Myc-His(+) DNA를 정제하였다. 정제한 DNA< 다시 EcoRI 및 Xhol 제한효소로 절단하고 1% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 로 염색하여 관찰한 결과 약 700 bp 크기의 DNA 띠가 확인되었다ig.
- 사람의 hGSTKl 유전자는 모유 두 세포 pBluescript phagemid cDNA library (Stratagene사, 미국)로부터 선별하였다. hGSTKl 유전자를 가진 E. coli로부터 hGSTKl phagemid를 Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega사, 미국을 이용하여 추출하였다.
- hGSTKl 유전자의 증폭을 위하여 PCR을 시행하였으며, PCR 반응에서 5' primer는 T3 primer를 사용하여 pBluescript phagemid의 EcoRI 절단 부위가 포함되도록 하였고, 3' primer 는 hGSTKl 유전자의 3, 부분의 종료 코 돈부에 Xhol 절단 부위가 포함되도록 hGSTKl 유전자 3, 부분을 다음과 같이 변형하여 디자인하였다{CITTAA — GAGCTC).
- hGSTKl이 이입된 세포와 hGSTKlo] 이입되지 않은 MCF- 7세포들을 trypsin-EDTA 처리하여 수확한 후, 세포수를 측정하였다. 5X1O5개의 MCF-7 세포를 10 ml DMEM 배양액이든 직경 100 mm 배양접시에 접종하였다.
- hGSTKl이 이입된 세포와 hGSTKl이 이입되지 않은 MCF- 7세포를 수확한 후 5X105개의 MCF-7 세포를 직경 100 mm 배양 접시에 분주하였다. 2 Gy 및 8 Gy의 엑스선을 비분할 조사하거나, 4 Gy 조사 후 4시간 후 다시 4 Gy를 분할조사 하였다 엑스선 조사 후 3, 6, 12, 24, 48시간에 세포를 취하여 RNAwiz and Superscript U (Ambion사, 미국)를 사용하여 RT-PCR을 시행하였다.
- SOC media 450를 첨가하고 37℃에서 3Q분간 배양하였다. LB-ampicillin 배지에 20 ml X-gal 25 M 및。」M IPTG 25 M를 각각 첨가하고 건조시킨 후 형질전환된 E. coH 100 M씩을 접종하여 37에서 24시간 배양하였다.
- 5 I이에 분산시킨 후, 100 “1씩 시험관에 분주하였다. 각 시험관에 pcDNA3.l/hGSTKl/Myc-His(+) DNA 15 finol을 첨가하여 살짝 저어준 후 얼음 위에 30분간 방치하였다, 90초간 42C의 열을 가한 후 얼음 위에 2분간 방치하였다. SOC media 450를 첨가하고 37℃에서 3Q분간 배양하였다.
- 엑스선 조사는 6 MV 선형가속기를 이용하였다. 비분할조사는 각각의 배양접시에 2, 4, 6, 8, 12 Gy의 엑스선을 조사하였고, 분할 조사는 4 Gy의 엑스선을 조사하고, 4시간 후에 다시 4 Gy의 엑스선을 조사하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에 2주간 배양한 후 crystal violet으로 염색하여 cokmy를 측정하였다.
- 비분할조사는 각각의 배양접시에 2, 4, 6, 8, 12 Gy의 엑스선을 조사하였고, 분할 조사는 4 Gy의 엑스선을 조사하고, 4시간 후에 다시 4 Gy의 엑스선을 조사하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에 2주간 배양한 후 crystal violet으로 염색하여 cokmy를 측정하였다. 50개 이상의 세포로 구성된 colony만을 유효한 것으로 하였다.
- 1/Myc-His(+) expression system을 사용하였다. 염기서열 분석은 Amersham사(미국)의 DNA sequencing kit을 사용하였고, in vitro translatione Pmomega사(미국) 의 TNT 17 quick coupled transcription/translation system을 사용하였다. MCF-7 세포로의 hGSTKl 유전자 이입을 위해 Qiagen사(미국)의 Superfect를 이용하였다.
대상 데이터
- 염기서열 분석은 Amersham사(미국)의 DNA sequencing kit을 사용하였고, in vitro translatione Pmomega사(미국) 의 TNT 17 quick coupled transcription/translation system을 사용하였다. MCF-7 세포로의 hGSTKl 유전자 이입을 위해 Qiagen사(미국)의 Superfect를 이용하였다. PCR (polymerase chain reaction) 및 RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction)을 위한 hGSTKl의 primer들은 한국 생공 제품을 사용하였다.
- 항생제 및 혈청이 첨가된 새 DMEM 배양액으로 갈아주고 48시간 동안 추가로 배양하였다. Neomycin이 함유된 DMEM 배양액으로 1:10계대배양을 시행하여 안정적으로 유전자 이입이 된 세포만을 선택하였다.
- hGSTKl 유전자를 과발현시키기 위한 vector로 5.5 kb 크기의 pcDNA3.1/Myc-His(+) expression system version A (Invitro- gen사, 미국)를 사용하였다. 이vector에는 cytomegalovirus (CMV) 촉진자 부위가 있으며, CMV 촉진자 이하 부위에 hGSTKl 유전자를 결합시키면 유전자의 과발현이 유도된다.
- 사람의 유방암 세포 MCF-7은 한국 세포주은행으로부터 구입하였으며, hGSTKl 유전자가 함유된 사람의 모유 두 세포 pBluescript pMgemid는 기질세포 유전자은행으로부터 구입하였다. hGSTKl 유전자를 과발현시키기 위한 vector로는 Invi- troger<미국)의 pcDNA3.1/Myc-His(+) expression system을 사용하였다. 염기서열 분석은 Amersham사(미국)의 DNA sequencing kit을 사용하였고, in vitro translatione Pmomega사(미국) 의 TNT 17 quick coupled transcription/translation system을 사용하였다.
- 사람의 hGSTKl 유전자는 모유 두 세포 pBluescript phagemid cDNA library (Stratagene사, 미국)로부터 선별하였다. hGSTKl 유전자를 가진 E.
- 사람의 유방암 세포 MCF-7은 한국 세포주은행으로부터 구입하였으며, hGSTKl 유전자가 함유된 사람의 모유 두 세포 pBluescript pMgemid는 기질세포 유전자은행으로부터 구입하였다. hGSTKl 유전자를 과발현시키기 위한 vector로는 Invi- troger<미국)의 pcDNA3.
- 5X1O5개의 MCF-7 세포를 10 ml DMEM 배양액이든 직경 100 mm 배양접시에 접종하였다. 엑스선 조사는 6 MV 선형가속기를 이용하였다. 비분할조사는 각각의 배양접시에 2, 4, 6, 8, 12 Gy의 엑스선을 조사하였고, 분할 조사는 4 Gy의 엑스선을 조사하고, 4시간 후에 다시 4 Gy의 엑스선을 조사하였다.
데이터처리
- 50개 이상의 세포로 구성된 colony만을 유효한 것으로 하였다. 동일한 실험을 5회 반복한 후, 엑스선량에 따른 생존분획을 Student's t-test를 이용하여 비교분석하였다.
이론/모형
- 1/ hGSTKl/Myc-His( +) DNA. Nucleotide sequence of hGSTKl cDNA in the recombinant pcDNA3.1/ hGSTKl/Myc-His( +) plasmid are confirmed using Sanger7s dideoxy nucleotide chain termination method. Myc-His( +) tag sequence derived from vector is underlined.
- 1/Myc-His(+) vector의 재단을 시행하였다. Phenol extraction method를 이용하여 제한효소에 의한 반응을 마친 각각의 DNA를 추출하였다.
- 정제한 DNA가 정확하게 삽입되었는지를 확인하기 위하여, Sanger's dideoxy nucleotide chain-termination method (Amer-s&m사, 미국)로 DNA의 염기서열을 분석하였다. 3, 부분이 변형된 hGSTKl의 종료 코 돈부 중 Xhol 제한효소 작용부위 이하가 pcDNA3.
성능/효과
- 쥐에서 클로닝 된 이 GST는 k 군으로 새로 분류되고 rGSTKl으로 명명되었다.1)최근에 rGSTKl과 70%의 상동성을 보여 hGSTKI 으로 추정되는 사람의 유전자가 클로닝 되었다. 사람의 대장암, 난소암, 폐암, 전립선암, 유방암 등 다양한 암세포에서 GST 유전자의 과발현이 보고되고 있다.
- 정제한 DNA가 정확하게 삽입되었는지를 확인하기 위하여, Sanger's dideoxy nucleotide chain-termination method (Amer-s&m사, 미국)로 DNA의 염기서열을 분석하였다. 3, 부분이 변형된 hGSTKl의 종료 코 돈부 중 Xhol 제한효소 작용부위 이하가 pcDNA3.1/Myc-His(+) 중 Xhol 제한효소 작용 부위 이하 부분으로 교체되어 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).
- 6). 4시간 간격으로 4 Gy씩 분할 조사한 후 시행한 RT-PCR에서도 시간에 따른 hGSTKl mRNA 발현 정도의 차이를 관찰할 수 없었다 (Fig. 7).
- 05). hGSTKl 유전자를 이입시킨 MCF-7 세포주의 4, 6, 8, 12 Gy 생존 분획도 hGSTKl 유전자를 이입시키지 않은 MCF-7 세포주에서 보다 더 높게 나타났다Q<0.05). 4시간 간격으로 4 Gy의 엑스선을 분할 조사한 경 우에도 hGSTKl 유전자를 이입시킨 MCF-7 세포주의 생존분획이 hGSTKl 유전자를 이입시키지 않은 MCF-7 세포주에서 보다 더 높게 나타났다 <0。5).
- 0319였다. hGSTKl 유전자를 이입시킨 MCF-7 세포주의 비분할 조사 후 2 Gy 생존 분획은 04125±0.0325으로 hGSTKl 유전자를 이입시키지 않은 MCF-7 세포주에서 보다 더 높게 나타났다(p<0.05). hGSTKl 유전자를 이입시킨 MCF-7 세포주의 4, 6, 8, 12 Gy 생존 분획도 hGSTKl 유전자를 이입시키지 않은 MCF-7 세포주에서 보다 더 높게 나타났다Q<0.
- hGSTKl 유전자의 염기서열에서 open reading ftame의 크기는 680 bp로서즈 5, primer 및 3, primere 위치 및 크기를 고려하면 PCR product의 크기는 약 700 bp 정도로 추정되었는데, 이는 3, 부분을 변형시킨 hGSTKl 유전자의 PCR 산물의 전기 영동 결과 약 700 bp 크기의 증폭된 DNA 띠와 일치하 였다(Fig. 1). Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega사, 미국)을 이용하여 PCR로 증폭시킨 DNA를 정제 하였다.
- 3(TC에서 1시간 반응시킨 후, SDS-PAGE를 시행하였다 전기 영동을 마친 gel을 -70℃에서 24시간 엑스선 필름에 노출시킨 후 현상하여 합성된 단백질을 확인하였다. 염기서열로 계산한 단백질의 분자량인 28.7 kDa과 동일한 분자량을 가진 단백질띠를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 유방암 세포에서 hGSTKI의 발현을 인위적으로 증가시킴으로써 방사선 감수성 변화를 관찰한 본 연구에서, 엑스선 조사 후 MCF-7 세포의 생존분획은 hGSTKI 유전자 이입 전후에 유의한 차이를 보여주었다. 이는 hGSTKI 유전자가 MCF-7 세포의 방사선 감수성에 관여하였다는 것을 의미한다.
- 1/hGSTKl/Myc-His(+) DNA를 정제하였다. 정제한 DNA< 다시 EcoRI 및 Xhol 제한효소로 절단하고 1% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 로 염색하여 관찰한 결과 약 700 bp 크기의 DNA 띠가 확인되었다ig. 2).
후속연구
- 결론적으로 MCF-7 세포주에서 hGSTKI의 과발현은 방사선 감수성에 영향을 미쳐서 MCF-7 세포의 생존분획을 증가시켰다고 볼 수 있으나 이에 대한 정확한 기전을 알기 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.
- 또한 GST?r 유 전자가 대장암 환자의 생존율을 예측할 수 있는 지표로도 사용할 수 있다고 하였다. 이러한 임상 관련 기초실험을 바탕으로 하여 향후 GST 유전자를 이용한 유전자 치료와 같은 새로운 치료방법이 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이와 같이 GST 유전자는 그 발현 양상이나 발현 시점 등이 세포에 따라, 효소군에 따라 일관성을 보이지 않고 있는데, 본 연구에서의 hGSTKI 유전자도 비록 정확한 정량 분석은 하지 않았지만 엑스선 조사 전후에 그 발현의 차이를 볼 수 없었다. 향후 더 다양한 세포주 및 GST 효소군에 대한 발현 양상 분석이 필요하다고 사료된다.
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