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문제 정의
- display (DD)이 개발되었다.7' 이에 DD 방법을 이용하여 자궁경부암 환자에서 방사선치료 중 발현이 증가하거나 감소하는 유전자를 검색하고자 하였다.
- 저자들은 DD RT-PCR 방법을 이용하여 방사선을 조사한 암 환자 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자를 검색하고자 하였다. DD RT-PCR방법으로 방사선조사를 받은 자궁경부암 조직과 방사선조사를 받지 않은 자궁경부암조직에서 특이적으로 발현되는 18개의 클론을 얻었다.
제안 방법
- 를 갖고 증폭반응을 실시하였다. 각 PCR 반응액의 조성은 cDNA 2 1에 10XPCR buffer 2 2 M H-AP primer 2 1, 2 "M H-T11M primer 2 25 M dNTP 1.6 1, 2000 Ci/mmol [a-33P]dATP 0.2 Taq polymerase 0.2 /A, dHzO를 첨가하여 최종 20 1 가 되게 하였다. 반응조건은 94 ℃ 30초 40 ℃ 2분, 72 ℃ 30초에서 40 cycle을 돌린 후 72 ℃ 5분 가온 후 40를 유지하였다.
- DD-PCR 의 단점이 잘못된 positive cDNA의 출현 빈도가 높고, sequencing gel로부터 특이적으로 발현되는 cDNA를 오려낼 때 다른 것들이 포함될 확률이 높다는 것인데, 이러한 이유 때문인지 7개의 클론은 발현의 차이가 없었다. 11개의 클론을 automatic system을 이용하여 sequencing 한 후에 Genbank database에서 BLAST search programl을 이용하여 상동성을 분석하였다. CxCa-4는 기존에 알려져 있는 유전자와 상동성을 전혀 보이지 않았으며, CxCa-5, CxCa-10, CxCa-11, 그리고 CxCa-13 등은 ZL 기능이 정확히 밝혀지지 않은 Human ESTs 인 것으로 확인되었다.
- 하였다. 180 cGy 방사선치료 후 40분에 자궁경부암 조직을 생검하여 방사선 조사군으로 같은 환자에서 방사선 치료 전에 생검하여 대조군으로 하였다.
- 1). 7개의 다르게 발현되는 DAN bands를 오려낸 후 겔로부터 cDNA 조각을 분리하였다. 깨끗하게 정제한 cDNA를 이전에 이용했던 pri- mer를 이용하여 재증폭한 후 pGEM-T Easy vector를 사용하여 subckming하였다.
- 이때 primer 는 CxCa-ir클론의 sequence를 이용하여 상용화된 primer desigen software를 이용하여 합성하였으며, 기대되는 product 크기는 162 bp였다. CxCa-11 클론이 방사선치료 시 작용하는 기전에 중요한 요인이라면 다른 방사선치료 중인 환자들에서 도 발현될 확률이 높을 것이라는 가정하에 방사선 치료 중인 5명의 자궁경부암 환자를 대상으로 RT-PCR을 수행하였으며, 이때 방사선치료전, 180 cGy 방사선치료 40분 후, 그리고 27 Gy 방사선치료 후의 시료를 대상으로 실험하였다. CxCa-11 클론이 방사선치료 전 시료에서 발현이 되었으며, 180 cGy 방사선치료 후 시료와 27 Gy 방사선치료 후 시료에서는 그 발현이 현저히 감소하거나 발현이 안되어 reverse Northern blot의 결과와 일치하였다.
- Northern blot 분석으로 얻어진 DD-PCR 산물들을 cloning 및 seguencing에 이용하였다. cloninge PCR2.
- 1 TA cloning vector# 이용하였디Vlnvitrogen). Seguencinge chain termination reaction에 의해 manual로 실시하거나 또는 Biomediclal Research center에 있는 automatic system을 이용하였다. cion 된 유전자 서열은 BLAST network 서비스를 통한 GenBank database 가지고 search 하였다.
- Total RNA 5 g과 oligo (dT)primer, dNTP, MMLV reverse trean-giptase를 첨가하고 RT반응을 시행하였다 이 RT 반응물을 random primed labeling 방법을 이용하여 radioactive probes를 합성하였다. 먼저 cDNA를 lOCTC에서 10분동안 가열해서 denature 시킨후 얼음에서 5분간 방치하였다.
- Total RNA는 Promega사의 SV total RNA 분리 system으로 manual에 따라 분리하였다. DD-PCR에 사용될 각각의 시료들은 반드시 DNase처리를 실시해서 genomic DNA 오염을 제거하였다.
- Total RNA를 RI로 표식하여 probe를 합성하였다. Total RNA 5 g과 oligo (dT)primer, dNTP, MMLV reverse trean-giptase를 첨가하고 RT반응을 시행하였다 이 RT 반응물을 random primed labeling 방법을 이용하여 radioactive probes를 합성하였다.
- Total RNA를 대조군 및 방사선 조사군에서 분리한 후 10 g을 nylon membrane에 20XSSC를 가지고 downward ca- pillary를 통하여 전이시킨 후 UV cross-linking 시켰다. Probe 합성은 slot blot screening을 통하여 확인된 다르게 발현되는 DNA들을 Random labeling 방법을 이용하여 [ a-32P]dCTP< 가지고 probe를 합성하였다.
- Total RNA에 존재하는 mRNA molecule을 역전사반응를 통하여 cDNA를 합성하였다. Total RNA 2 에 5XRT buffer 4 H-T11M 2 1, 250 "M dNTP 1.
- 5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)을 가하고 10 N 의 oligo-dT15와 RNase inhibitor 및 1U 의 reverse transcriptase를 가하고 총 반응액이 20 ul가 되도록 증류수를 가한 후 3 71에서 1시간 반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA 산물은 95℃ 에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 불활화시킨 다음 얼음에 담가 급냉하였다 이렇게 생성된 cDNA산물을 가지고 다음과 같은 동일한 조건에서 PCR을 시행하였다. 즉, 4 ul의 10XPCR buffer, 4 ul의 2.
- 1% SDS 세정액에 옮긴 후 &TC에서 30분간 세정하였다. membrme를 sgn-wrap으로 덮고 초저온 freezer (-70C)에서 증감지를 사용하여 X선 필름에 노광하였다, 대조군과 비교하여 현저한 차이가 나는 DNA를 Northern Blotting 통해 확인하였다
- prehybridizatioii 용액을 버리고 새로운 hybridization용액을 첨가한 후 3X105 cpm/ml의 RI 표식 와 salmon sperm DNA를 첨가하였으며 68 ℃ 에서 overnight hybridization하였다. membrane을 조심스럽게 꺼낸 후 2XSSC와 0.
- 약5g의 total RNA에 I XDNase Ibufr와 en- zyme을 첨가하고 37 ℃ 30분간 반응시켰다. 각 RNA sample들은 spectrophotometer를 이용하여 260 nm에서 정량한 후 아가로스 겔 전기 영동하여 28s와 18s band를 확인하였다
- 7개의 다르게 발현되는 DAN bands를 오려낸 후 겔로부터 cDNA 조각을 분리하였다. 깨끗하게 정제한 cDNA를 이전에 이용했던 pri- mer를 이용하여 재증폭한 후 pGEM-T Easy vector를 사용하여 subckming하였다.
- 10mer의 arbitrary primei.를 갖고 증폭반응을 실시하였다. 각 PCR 반응액의 조성은 cDNA 2 1에 10XPCR buffer 2 2 M H-AP primer 2 1, 2 "M H-T11M primer 2 25 M dNTP 1.
- RT-PCRe 각각의 조건에서 2의 total RNA를 이용하였다. 먼저 RNA시료를 65℃에서 5 분간 가열하고 변성시키고 얼음에 급냉시킨 후 2 M의 10X RT buffer, 2 1의 dNTP (2.5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP)을 가하고 10 N 의 oligo-dT15와 RNase inhibitor 및 1U 의 reverse transcriptase를 가하고 총 반응액이 20 ul가 되도록 증류수를 가한 후 3 71에서 1시간 반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA 산물은 95℃ 에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 불활화시킨 다음 얼음에 담가 급냉하였다 이렇게 생성된 cDNA산물을 가지고 다음과 같은 동일한 조건에서 PCR을 시행하였다.
- 본 연구에서 이용한 primer set는 바이오니아에 주문 합성하여 사용하였으며 Total RNA를 주형으로 역전사 반응에 의하여 cDNA를 만들고 이어서 PCR에 의하여 DNA를 증폭하였다. RT-PCRe 각각의 조건에서 2의 total RNA를 이용하였다.
- Reverse nothem blot을 수행한 결과 CxCa-11 클론이 방사선조사 시 발현이 감소하는 양상을 보였다. 이 클론을 증폭할 수 있는 primer를 제작하여 5명의 자궁암환자들에서는 CxCa-11 클론이 어떠한 발현양상을 보이는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 primer sequence와 기대되는 product size는 Fig.
- 자궁경부암 환자에 대한 방사선 조사는 본과의 자궁경부암 치료 protocol에 따라 환자를 setup하고 선형가속기를 이용하여 180 cGy를 조사하였다.
- 이 중 4 1를 위의 DD-PCR 에서 사용한 동일한 조성과 조건에서 동일한 prer를 가지고 재 증폭하였다. 재 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose 겔에서 전기 영동하여 크기를 확인하였다
- cDNA 산물은 95℃ 에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 불활화시킨 다음 얼음에 담가 급냉하였다 이렇게 생성된 cDNA산물을 가지고 다음과 같은 동일한 조건에서 PCR을 시행하였다. 즉, 4 ul의 10XPCR buffer, 4 ul의 2.5 mM dNTP mixture, 20 의 3'primer 및 5 primer, 1 U Taq DNA polymerase를 각 eppen- dorf tube에 첨가하여 총반응액이 40 ul가 되도록 증류수를 가한 후 PCRe DNA thermal cycla를 사용하여 시행하였다 CxCa-11 mRNA 발현분석을 위한 PCR 조건은 denaturatieme 94℃에서 1부 annealinge 57℃에서 1분 extensione 72℃에서 1분간 시행하여 35회의 cDNA 증폭반응을 시행하였다.
- 증폭된 PCR산물을 8M urea가 포함된 6% polyacryl amide 겔을 이용하여 분리하였다. 1200V에서 3시간 정도 runnig하여 BPB가 겔의 하단부분에 내려올 때까지 전기 영동하였다.
- 필름을 현상한 후 방사선에 의해서 다르게 발현되는 band 를 잘라내고 dH2O 100 1를 첨가해서 KXTC15분간 가열하여 DNA를 용출해 냈다. 용출된 DNA를 glycogen, sodium acetate, 100% EtOH-f- 첨가해서 침전시켰다.
대상 데이터
- 18세 이상이며 80세 미만으로 조직학적으로 확진된 악성종양이며 종양은 육안적으로 확인 가능하고 접근이 가능한 부위에 위치하여 생검이 가능한 자궁경부암 환자를 대상으로 하였다. 180 cGy 방사선치료 후 40분에 자궁경부암 조직을 생검하여 방사선 조사군으로 같은 환자에서 방사선 치료 전에 생검하여 대조군으로 하였다.
- DD-PCR 빙-법을 이용하여 방사선 조사군에서 발현이 증가 또는 감소된 18개의 클론을 발견하였다(Fig. 1). 7개의 다르게 발현되는 DAN bands를 오려낸 후 겔로부터 cDNA 조각을 분리하였다.
이론/모형
- Differential Display는 Liang과 Pardee에 의해 고안된 방법에 의한 RNA Image와 Display system 회사의 display PROFILE- BASIC Eukajyotic kit을 이용하여 실시하였다.
- Probe 합성은 slot blot screening을 통하여 확인된 다르게 발현되는 DNA들을 Random labeling 방법을 이용하여 [ a-32P]dCTP< 가지고 probe를 합성하였다. 이 probe 합성이 끝난 반응물을 즉시 Sephadex spin column을 이용하여 반응하지 않은 nucleo tide를 제거하였다.
- Nothem blote RNA의 정성, 정량을 시행하기 위하여 가장 일반적으로 이용되는 방법으로서 RNA의 품질이 나쁘다든지 목적하는 mRNA의 prevalance가 매우 낮다든지, 또한 다른 실험방법 등에 오류가 있을 시에 그 결과를 얻기가 어렵다. 본 실험에서는 mRNA의 발현 정도가 낮은 것이 원인일 것이라는 가정 하에 극히 소량의 경우에도 증폭이 가능하여 mRNA의 prevalance에 관계없이 그 존재유무를 확인할 수 있는 RT-PCR 방법을 이용하였다. 이때 primer 는 CxCa-ir클론의 sequence를 이용하여 상용화된 primer desigen software를 이용하여 합성하였으며, 기대되는 product 크기는 162 bp였다.
성능/효과
- CxCa-11 클론은 방사선조사를 받지 않은 암세포에서 발현 정도가 높았으며 기존에 밝혀진 유전자와는 전혀 상동성을 보이지 않는 새로운 유전자로서 Human Uterus Homo sapiens cDNA 5, end와 93%의 상동성을 보였다. reverse Northern 결과를 검증하기 위하여 Northern blot을 수행하였으나 결과를 얻지 못하였다.
- CxCa-11 클론이 방사선치료 시 작용하는 기전에 중요한 요인이라면 다른 방사선치료 중인 환자들에서 도 발현될 확률이 높을 것이라는 가정하에 방사선 치료 중인 5명의 자궁경부암 환자를 대상으로 RT-PCR을 수행하였으며, 이때 방사선치료전, 180 cGy 방사선치료 40분 후, 그리고 27 Gy 방사선치료 후의 시료를 대상으로 실험하였다. CxCa-11 클론이 방사선치료 전 시료에서 발현이 되었으며, 180 cGy 방사선치료 후 시료와 27 Gy 방사선치료 후 시료에서는 그 발현이 현저히 감소하거나 발현이 안되어 reverse Northern blot의 결과와 일치하였다. 이는 CxCa-11 클론이 방사선 치료 시 분자생물학적인 기전에 어떤 역할을 할 것을 강하게 시사한다.
- 11개의 클론을 automatic system을 이용하여 sequencing 한 후에 Genbank database에서 BLAST search programl을 이용하여 상동성을 분석하였다. CxCa-4는 기존에 알려져 있는 유전자와 상동성을 전혀 보이지 않았으며, CxCa-5, CxCa-10, CxCa-11, 그리고 CxCa-13 등은 ZL 기능이 정확히 밝혀지지 않은 Human ESTs 인 것으로 확인되었다. 또한 CxCa-7, CxCa-9 그리고 CxCa-15 클론은 각각 chromosome 13, 19 그리고 15번에 위치한 DNA sequence인 것으로 나타났다.
- CxCa-8 클론이 세포증식과 관련된 Homo sapiens similar to proliferation-associated protein 204 단백질과 높은 상동성을 보였다. Halahan 등은 방사선에 의한 조기유전자 발현의 산물은 TNF, basic fibroblast growth factor, IL-1, 그리고 TGF-g 등의 secondary response gene을 발현시켜 각종 growth factor, cytokine을 분비시켜 결국 세포사망유도, 손상된 DNA의 회복, cell cycle perturbation, 세포생존, apoptosis 등을 일으킨다고 했다.
- DD RT-PCR방법으로 방사선조사를 받은 자궁경부암 조직과 방사선조사를 받지 않은 자궁경부암조직에서 특이적으로 발현되는 18개의 클론을 얻었다. Reverse Northern blot 으로 확인한 결과 1개의 클론은 방사선조사를 조사하지 않은 암조직에서 발현정도가 높았으며, 10개의 클론은 방사선 조사를 받은 암조직에서 발현정도가 높게 나타났다. DD-PCR 의 단점이 잘못된 positive cDNA의 출현 빈도가 높고, sequencing gel로부터 특이적으로 발현되는 cDNA를 오려낼 때 다른 것들이 포함될 확률이 높다는 것인데, 이러한 이유 때문인지 7개의 클론은 발현의 차이가 없었다.
- Reverse nothem blot을 수행한 결과 CxCa-11 클론이 방사선조사 시 발현이 감소하는 양상을 보였다. 이 클론을 증폭할 수 있는 primer를 제작하여 5명의 자궁암환자들에서는 CxCa-11 클론이 어떠한 발현양상을 보이는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
- CxCa-4는 기존에 알려져 있는 유전자와 상동성을 전혀 보이지 않았으며, CxCa-5, CxCa-10, CxCa-11, 그리고 CxCa-13 등은 ZL 기능이 정확히 밝혀지지 않은 Human ESTs 인 것으로 확인되었다. 또한 CxCa-7, CxCa-9 그리고 CxCa-15 클론은 각각 chromosome 13, 19 그리고 15번에 위치한 DNA sequence인 것으로 나타났다.
- 3에 기술하였다. 모든 환자에서 방사선치료 전 시료에서 발현을 보였으나, 방사선치료 후 시료에서는 그 발현량이 감소하거나 발현이 안되었다(Fig. 4).
- 본 실험결과에서 저자들이 가장 관심을 갖고 있는 CxCa- 12 클론은 방사선조사 후에 더 많은 발현정도를 보였으며 chemokine receptor인 CXCR4와 91% 상동성을 보였다. CXCR4에 대한 연구는 오래 전부터 많이 되어져왔으며, 이것은 stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) 의 specific receptor중 하나이며, HIV 감염시에 coreceptor로도 작용한다 CXCR4와 SDF-1 이 결합하여 말초 혈액 림파구와 혈관 내피 세포가 chemoattractant하게 한다.
- 클로닝된 cDNA 조각들은 대부분 400 ~500 bp 정도 되었으며, 그 중 1개의 클론은 잘 알려져 있는 chemokine receptor CXCR4 유전자와 높은 상동성을 보였으며, 4개의 클론은 Human ESTs로 확인되었고 5개의 클론은 기능이 아직 확인 되지 않은 알려져 있는 염기서열로 확인되었으며, 1개의 클 론은 어떤 유전자와도 match되지 않았다(Table 1).
후속연구
- CXCR4에 대한 연구는 오래 전부터 많이 되어져왔으며, 이것은 stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) 의 specific receptor중 하나이며, HIV 감염시에 coreceptor로도 작용한다 CXCR4와 SDF-1 이 결합하여 말초 혈액 림파구와 혈관 내피 세포가 chemoattractant하게 한다.'' 13) Panomaryov 등은 SDF-1 이 DNA damage가 일어났을 경우 host defense response에 관여한다는 보고를 하였다 본 실험에서 클로닝한 CXCR4를 고려해볼 때 방사선치료의 분자생물학적인 기전이 SDF-1 이 관여하는 일련의 신호전달경로와 어떤 연관이 있음을 추정할 수 있으며, 그러한 과정에서 CXCR4가 방사선치료의 효과를 예측하는데 도움이 되리라고 사료된다.
- 앞으로 CxCa-11 클론의 완전한 유전자를 클로닝하고 그 유전자가 방사선치료 시 관여하는 분자생물학적인 기전에 어떤 역할을 하는지에 대하여 계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 실험에서 얻은 결과들은 자궁경부암에 대한 방사선치료 기전 연구에 초석이 될 것으로 사료된다.
- 이는 CxCa-11 클론이 방사선 치료 시 분자생물학적인 기전에 어떤 역할을 할 것을 강하게 시사한다. 앞으로 CxCa-11 클론의 완전한 유전자를 클로닝하고 그 유전자가 방사선치료 시 관여하는 분자생물학적인 기전에 어떤 역할을 하는지에 대하여 계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 실험에서 얻은 결과들은 자궁경부암에 대한 방사선치료 기전 연구에 초석이 될 것으로 사료된다.
- Halahan 등은 방사선에 의한 조기유전자 발현의 산물은 TNF, basic fibroblast growth factor, IL-1, 그리고 TGF-g 등의 secondary response gene을 발현시켜 각종 growth factor, cytokine을 분비시켜 결국 세포사망유도, 손상된 DNA의 회복, cell cycle perturbation, 세포생존, apoptosis 등을 일으킨다고 했다. 이런 점을 고려해본다면 CxCa-8 유전자가 방사선치료의 분자생물학적 기전에 관련이 있을 수 있을 것으로 사료되어 이를 확인하기 위하여 CxCa-8 클론의 완전한 유전자를 클로닝하고 그 유전자가 방사선치료 시 관여하는 분자생물학적인 기전에 어떤 역할을 하는지에 대하여 계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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