유가식배양과 세라믹 막을 장착한 생물반응기에서 운전인 TCRC 조업을 통해서 Bacillus thuringiensis의 고농도 세포배양을 실시하였다. 유가식 배양에서 B. thuringiensis의 세포 성장은 선형적으로 증가하였고, 이것은 세포성장 모델리의 결과와 잘 맞았다. 낮은 세포 성장속에도 불구하고 유가식 배양동안에 포자형성은 관찰할 수 없었고, 이것은 연속배양의 결과와는 반대였다. 유가식 조업 후에 회분식 배양으로 바꾸면 300 g/L의 포도당 공급 농도를 사용했을 때 2.7$\times$$10^9$ CFU/mL 의 포자농도를 얻었다. 생물반응기내에 세라믹 막을 장착한 TCRC 조업에서 포도당 공급 농도의 영향을 결정하였다. 50 g/L의 포도당 농도를 사용했을 때 TCRC 조업에서 82.5 g-cell/L에 해당하는 최대 세포농도 1.8$\times$$10^{10}$ CFU/mL 를 얻었다. TCRC에서 세포성장은 선형적으로 증가하였고 포도당 농도는 제한되었는데 이것은 세포성장은 모델링의 결과와 잘 일치하였다. 1 g/L의 포도당을 공급한 경우 이외에는 TCRC 조업 동안에 포자형성을 관찰할 수 없었다. 50 g/L의 포도당을 공급한 경우 TCRC조업 후에 회분식 배양으로 전환시키면 1.2$\times$$10^{10}$ CFU/mL 의 포자농도를 얻었고, 이것은 연구된 여러 배양형태 중에 가장 높은 포자농도이다. 이 때 최적의 포도당 공급속도는 0.55 g glucose/h로 공급하였을 때였다.
유가식배양과 세라믹 막을 장착한 생물반응기에서 운전인 TCRC 조업을 통해서 Bacillus thuringiensis의 고농도 세포배양을 실시하였다. 유가식 배양에서 B. thuringiensis의 세포 성장은 선형적으로 증가하였고, 이것은 세포성장 모델리의 결과와 잘 맞았다. 낮은 세포 성장속에도 불구하고 유가식 배양동안에 포자형성은 관찰할 수 없었고, 이것은 연속배양의 결과와는 반대였다. 유가식 조업 후에 회분식 배양으로 바꾸면 300 g/L의 포도당 공급 농도를 사용했을 때 2.7$\times$$10^9$ CFU/mL 의 포자농도를 얻었다. 생물반응기내에 세라믹 막을 장착한 TCRC 조업에서 포도당 공급 농도의 영향을 결정하였다. 50 g/L의 포도당 농도를 사용했을 때 TCRC 조업에서 82.5 g-cell/L에 해당하는 최대 세포농도 1.8$\times$$10^{10}$ CFU/mL 를 얻었다. TCRC에서 세포성장은 선형적으로 증가하였고 포도당 농도는 제한되었는데 이것은 세포성장은 모델링의 결과와 잘 일치하였다. 1 g/L의 포도당을 공급한 경우 이외에는 TCRC 조업 동안에 포자형성을 관찰할 수 없었다. 50 g/L의 포도당을 공급한 경우 TCRC조업 후에 회분식 배양으로 전환시키면 1.2$\times$$10^{10}$ CFU/mL 의 포자농도를 얻었고, 이것은 연구된 여러 배양형태 중에 가장 높은 포자농도이다. 이 때 최적의 포도당 공급속도는 0.55 g glucose/h로 공급하였을 때였다.
High cell density culture of Bacillus thuringiensis was conducted in fed-batch culture and TCRC using a bioreactor incorporating ceramic membrane filter. Cell growth of B. thuringiensis in fed-batch culture increased linearly, which was well matched by the results of cell growth modeling. In spite o...
High cell density culture of Bacillus thuringiensis was conducted in fed-batch culture and TCRC using a bioreactor incorporating ceramic membrane filter. Cell growth of B. thuringiensis in fed-batch culture increased linearly, which was well matched by the results of cell growth modeling. In spite of the slower growth rate during fed-batch culture, no spore formation was observed, which was contrary to the results of continuous culture. Changing culture mode to batch culture after fed-batch operation induced a 2.7$\times$$10^9$ CFU/mL spore concentration using a 300 g/L glucose feed concentration. In TCRC operation incorporating ceramic filter within the bioreactor, the effect of glucose feed concentrations on the cell growth and spore formation of B. thuringiensis was determined. A maximum cell concentration of 1.8$\times$$10^{10}$ CFU/ml, which corresponds to 82.6 g-cell/L, was obtained in the TCRC using a 50 g/L glucose feed concentration. In the TCRC, cell growth increased linearly and glucose concentration was limited, which agreed well with the results of cell growth modeling. No spore formation was observed except when 1 g/L of glucose was fed. Changing to batch culture induced a 1.2$\times$$10^{10}$ CFU/mL of spore concentration, which was the highest spore concentration obtained among the various culture modes examined. The optimal glucose feed rate was found to be 0.55 g-glucose/h.
High cell density culture of Bacillus thuringiensis was conducted in fed-batch culture and TCRC using a bioreactor incorporating ceramic membrane filter. Cell growth of B. thuringiensis in fed-batch culture increased linearly, which was well matched by the results of cell growth modeling. In spite of the slower growth rate during fed-batch culture, no spore formation was observed, which was contrary to the results of continuous culture. Changing culture mode to batch culture after fed-batch operation induced a 2.7$\times$$10^9$ CFU/mL spore concentration using a 300 g/L glucose feed concentration. In TCRC operation incorporating ceramic filter within the bioreactor, the effect of glucose feed concentrations on the cell growth and spore formation of B. thuringiensis was determined. A maximum cell concentration of 1.8$\times$$10^{10}$ CFU/ml, which corresponds to 82.6 g-cell/L, was obtained in the TCRC using a 50 g/L glucose feed concentration. In the TCRC, cell growth increased linearly and glucose concentration was limited, which agreed well with the results of cell growth modeling. No spore formation was observed except when 1 g/L of glucose was fed. Changing to batch culture induced a 1.2$\times$$10^{10}$ CFU/mL of spore concentration, which was the highest spore concentration obtained among the various culture modes examined. The optimal glucose feed rate was found to be 0.55 g-glucose/h.
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문제 정의
공급배지의 포도당의 농도에 따른 세포와 포자형성의 특성을 TCRC 조업에서 살펴보았다. Figure 3은 TCRC조업에서 포도당 농도에 따른 세포성장의 특성을 보여주고 있다.
본 연구는 유가식 배양 및 기존의 세포재순환 배양방법과 달리 생물반응기 내부에 세라믹 막 필터를 장착한 TCRC(total cell retention culture) 조업을 통해서 B. thuringiensis의 고농도 세포배양을 실시하면서 세포 성장 및 포자 형성의 특성을 파악하고 고농도 배양에서 세포 성장속도를 모델링하여 실험결과와 비교하고자 한다.
유가식 배양이 끝난 후에 다시 회분식 배양을 통해서 세포를 포자로 전환시키고자 하였다. 이때 300g/L의 포도당 농도로 공급한 유가식 배양의 경우에만 2.
제안 방법
GYS배지를 사용하여 연속배양을 실시하였고 희석율에 대한 세포 성장 및 포자 형성의 영향을 조사하였다 (Figure 1). 포자의 생성비율은 희석율이 낮을수록 증가함을 알 수 있다.
Monod 식을 따르는 비구조적 모델을 사용하여 세라믹 막 필터를 사용한 TCRC 운전에서 세포성장의 특성을 관찰하기 위해 세포 성장에 대한 모델링을 실시하였다. 물질 수지식을 세우면 다음과 같다.
배지를 공급하기 전에 회분식으로 배양으로 세포가 지수성장기에 도달하는 5-8hr에 유가식배양을 시작하였다. 공급되는 배지의 탄소원인 포도당의 농도를 달리하면서 세포성장과 포자형성을 관찰하였다.
공급배지의 포도당 농도를 25와 50 g/L로 하고 희석율을 0.11h-1로 조업했을 때 TCRC 조업에서 세포성장과 포자형성을 관찰하였다(Figure 3
kurstaki HD-1(ATCC 33679)을 사용하였다. 균주는 nutrient agar stock plate[0.8% Nutrient Broth(Difco), 0.5% NaCl 그리고 2.0% Bacto-Agar(Difco)]에서 4℃로 보관하였고 2주일마다 계대하였다. 세포 성장 및 포자 형성을 위한 기본 배지로 GYS배지를 사용하였다(15).
0과 온도 30℃로 유지하였다. 그리고 용존산소농도를 2-3ppm으로 유지하기 위해 공기와 산소를 혼합하여 40%(v/v)의 산소농도가 되도록 공기를 공급하였다. 공급배지는 일정속도로 peristaltic 펌프(Cole Parlmer, Chicago, IL, USA)로 공급하였고 이 때 초기배양액의 부피는 0.
본 실험에서는 배지를 일정한 속도로 공급하고 또한 배지의 포도당의 농도를 달리하면서 유가식 배양에서 세포성장과 포자형성의 특성을 조사하였다(Figure 2). Figure 2에서 알 수 있듯이 각 공급배지의 농도에서 세포성장은 앞에서 제시된 비구조적 모델과 잘 일치하는 선형적으로 증가하였고 공급배지의 포도당 농도를 높일수록 더 높은 세포농도를 얻을 수 있었다.
생균수의 측정은 nutrient broth agar 배지에서 pour plate 방법을 사용하였고 30℃에서 배양하여 colony가 형성되면 그 개수를 측정하여 colony forming unit (CFU)를 결정하였다. 열저항성을 갖는 포자의 결정은 65℃에서 45분 가열한 후 위와 같은 방법으로 colony forming unit를 결정하였다.
7×109CFU/mL의 포자농도를 얻었다. 생물반응기내에 세라믹 막을 장착한 TCRC 조업에서 포도당 공급 농도의 영향을 결정하였다. 50g/L의 포도당 농도를 사용했을 때 TCRC 조업에서 82.
0% Bacto-Agar(Difco)]에서 4℃로 보관하였고 2주일마다 계대하였다. 세포 성장 및 포자 형성을 위한 기본 배지로 GYS배지를 사용하였다(15). GYS배지는 증류수 1L에 1.
연속배양은 1L의 발효기(Bioflo C-30, New Brunswick Scientific, NJ, USA)를 사용하여 실시하였고 공급되는 배지는 GYS배지를 사용하였으며 공급 유량을 달리하면서 희석율(dilution rate)을 조절하였다. 정상상태에서 샘플링은 세포농도와 기질의 농도가 일정하게 유지되는 3-5 체류시간이 지난 다음에 실시하였다.
유가식배양과 세라믹 막을 장착한 생물반응기에서 운전인 TCRC 조업을 통해서 Bacillus thmringiensis의 고농도 세포배양을 실시하였다. 유가식 배양에서 B.
세척하여 다시 원심분리하였다. 이 과정을 두 번 반복하였고 회수된 세포를 105℃ 오븐에서 16시간 후에 건조질량의 무게를 측정하였다. 흡광도는 1.
07g MnSO4·H2O를 포함하고 있다. 침전을 방지하기 위해 glucose, MgSO4·7H2O, CaCl2·2H2O 그리고 MnSO4·H2O를 따로 멸균하였고 (NH4)2SO4, K2HPO4 그리고 yeast extract의 용액은 2N KOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정하였다.
대상 데이터
본 실험의 균주는 Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1(ATCC 33679)을 사용하였다. 균주는 nutrient agar stock plate[0.
성능/효과
17g/h인데 이것보다 높은 경우에는 운전 중에 포자형성을 관찰할 수 없었다. 공급배지의 포도당 농도가 10g/L에서도 포도당 공급속도가 0.17g/h 이하로 되게 공급속도를 낮추면 포자형성을 관찰할 수 있었다.
Table 1에 나와 있지 않지만 100g/L의 포도당 농도로 운전하였을 경우에는 포도당이 제한되지 않았고 운전 후에도 회분식 배양을 통해서 포자형성을 관찰할 수 없었다. 따라서 TCRC 조업은 공급배지의 포도당 농도와 배지의 공급속도를 적절히 조절함으로써 최적의 결과를 얻을 수 있는데 본 실험에서는 배지의 포도당 농도는 50g/L이고 공급속도는 0.11h-1로서 포도당 공급속도를 0.55g-glucose/hr로 운전했을 때였다.
1g/L의 포도당 농도를 공급한 경우에 세포성장은 전형적인 선형의 성장특성을 보였다(Figure 3(a)). 또한 운전 후 15시간에서 포자가 관찰되었고 포자농도의 경향도 선형적으로 증가함을 알 수 있었다. TCRC조업 후의 전체세포 농도는 2.
2×1010CFU/mL이었다. 세포성장은 모델링의 결과와 잘 일치하였고 소모된 포도당 농도에 대한 세포 수율은 0.65 g-cell mass/g-glucose 였다.
실시하였다. 유가식 배양에서 B. thurizigiensis의 세포 성장은 선형적으로 증가하였고, 이것은 세포성장 모델리의 결과와 잘 맞았다. 낮은 세포 성장속도에도 불구하고 유가식 배양동안에 포자형성은 관찰할 수 없었고, 이것은 연속배양의 결과와는 반대였다.
이것은 1g/L의 포도당 농도로 공급한 경우에 비해서 세포농도가 3배 이상 증가했음을 알 수 있다. 포자형성은 TCRC조업 후에 회분식 배양으로 전환했을때 관찰되었고 포자농도는 7.2×109CFU/mL을 얻을 수 있었다. 이것은 세포의 70% 이상이 포자로 전환되었음을 알 수 있다.
후속연구
thuringiensis를 연속배양에 의해 생산하는 것은 불리한데 그것은 포자의 농도가 연속배양에서 희석율에 반비례하기 때문이다. 하지만 본 실험에서 포자의 생성과 희석율의 관계를 통해서 세포의 성장속도를 감소시킬 수 있는 고농도 배양방법을 채택하면 효과적으로 B. thuringiensis를 생산할 수 있을 것으로 기대된다.
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