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문제 정의
- MSM 배지에 포함되는 디젤유의 농도에 변화를 추어 미생 물의 생장 및 디젤유 분해능에 미치는 영향을 알아보았다. Figure 4에서 알 수 있듯이 0.
- 본 실험에서는 실제 유류 오염지역으로부터 직접 유류분해 균주를 분리하여 그 균주를 이용한 유류분해 효율을 높이는 데 초점을 두고 진행되었다. 대상 유류로는 디젤유를 선정하 였고, 액체베지에서의 디젤유 분해능을 기초로 토양컬럼을 제작하여 실제 토양에서의 분해능을 알아보았다.
제안 방법
- 잔류 디젤유의 분석은 EPA method 8015를 따라 행하였다(7). Gas chromatography(Shimadzu GC-17A)를 사용하였으며 GC 컬럼으로는 HP-5 capillaiy column(30 m, 0.25 mm diameter, 0.25 pm film thickness)-g- 사용하였다. Normal hexane으로 추 츨한 후 GC를 통해 분리된 디젤유의 탄화수소의 총량은 total petroleum hydrocarbon(TPH)방법으로 정량하였다.
- 위에서 얻은 각각의 콜로니를 디젤을 포함 하는 minimal salt media (MSM) (6) 에서 1 주일간 배양한 후 다시 nutrient 배지에 도말하여 활성이 좋은 균을 분리하였다. MSM의 구성은 Table 1과 같으며 디젤유는 0.2 呻 filter로 여과한 후 사용하였다- 위에서 얻은 균주들을 3차례 계대배 양한 후 디젤 분해능이 좋은 2종류의 균주를 분리하였다. 이 들은 평판 배양시 각각 백색의 콜로니와 황색의 콜로니를 형 성하였으며 이에 따라 백색 콜로니를 형성하는 균주, 황색 콜로니를 형성하는 균주, 그리고 두 균주를 혼합하여 배양하여 얻은 균주를 각각 W균주(while colony strain), Y균주(yellow colony strain), WY균주(white and yellow colony strain)로 명 명하였고 KCCM(Korean culture collection of microorganisms) 에 균주의 동정음위한 지방산 분석음 의뢰하였다.
- 디젤유의 양이 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 MSM에 포함되는 디젤유의 양을 달리하여 그 분해능을 측정하였다. 각각 0.5%, 1%, 2%, 4%의 디젤유를 MSM에 첨가한 후 각각의 균주를 2% 접종하여 10일간 배양하였다. ,
- 공기의 유속을 30 n山/min으로 공급하여 주면서 질소원 NaNS와 오염된 디젤유와의 질량비가 100:5, 100:10, 100:15가 되도록 히-여 4일이 지난 후에 질소원 NaNCb를 멸균된 증 류수 200 mL에 녹여 60 niL/min으로 토양컬럼에 첨가해주면 서 디젤유의 분해양상과 미생물 생장을 관찰하였다.
- 균주의 양이 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 각각의 균주의 접종량을 달리하여 그 분해능을 측정하였다. 접종 량을 각각 0.
- 균주의 접종량을 달리하여 각각의 디젤유 분헤정도를 측정하였다. 약 2일간 배양하였을 떼 Figui-e 3에서와 같이 접종 량을 4%로 하였음 때 WY균주의 경우 약 78%의 디젤유가 감소되어 0.
- 본 실험에서는 실제 유류 오염지역으로부터 직접 유류분해 균주를 분리하여 그 균주를 이용한 유류분해 효율을 높이는 데 초점을 두고 진행되었다. 대상 유류로는 디젤유를 선정하 였고, 액체베지에서의 디젤유 분해능을 기초로 토양컬럼을 제작하여 실제 토양에서의 분해능을 알아보았다.
- 디젤유의 양이 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 MSM에 포함되는 디젤유의 양을 달리하여 그 분해능을 측정하였다. 각각 0.
- 디젤유는 여러가지 물질로 이루어진 혼합물이기 때문에 어느 한 종의 미생물보다는 복합균주를 사용하였을 때 분해 효율이 늪아질 가능성이 높다. 본 실험에서는 W, Y균주를 각각 사용한 경우와 두 균주를 혼합한 WY균주를 사용한 경우의 분해능을 비교하였다. Figure 2에서 알 수 있뜻이 W균주 와 Y균주를 따로 접종하였을 떼 보다 복합균주인 WY균주를 사용하였을 경우 4~10%의 디젤유가 더 분해됨을 알 수 있었 다 또한 WY균주를 첨가한 경우 20일 후 디젤유가 약 73% 가 감소한 반면 미생물을 첨가하지 않은 control 배지의 겅우 약 45%의 디젤유가 감소하였는데 이는 미생물이 디젤유를 상당량 분해함을 나타내나 휘발에 의헤서도 많은 양의 디젤 유가 갂소함을 알 수 있다.
- 분리된 균의 분해능을 측정하기 위해 nutrient media에서 배양된 W균주, Y균주, WY균주를 각각 디젤유를 포함하는 MSM에 2%를 접종하여 20弋, 200 rpm에서 20일간 배양하였다. 균주릍 접종하지 않은 control배지도 같은 조건에서 20일 간 함께 두었다.
- 유류로 오염되어있는 지역의 토양 시료를 채취한 후, 디젤 을 분해할 수 있는 균주를 분리하였다. 분리방법은 우선 토 양 시료를 증류수에 풀어 nutrient 배지 (beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L) 에 도말하여 가능한 모든 콜로니를 분리하여 각각 배양하였다. 위에서 얻은 각각의 콜로니를 디젤을 포함 하는 minimal salt media (MSM) (6) 에서 1 주일간 배양한 후 다시 nutrient 배지에 도말하여 활성이 좋은 균을 분리하였다.
- 균주의 양이 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 각각의 균주의 접종량을 달리하여 그 분해능을 측정하였다. 접종 량을 각각 0.
- 선별된 우수 균주를 이용하여 토양에서의 디젤유 분해능을 알아보기 위해 토양컬럼을 제작하였다(Figure 1). 컬럼은 다른 연구(8)를 기초로 총 4개의 컬럼을 제작 사용하였으며, 각 컬럼의 총 부피는 대략 2 L이었디.
- 앞서 언급한 바와 같이 영양염류는 미생물의 디젤분해에 중요한 인차로 작용하는데, 본 실험에서는 공기의 유속을 30 mL/min으로 공급하여 주면서 질소원인 N고]- 오염된 디젤 유와의 질링帀]가 100:5, 100:10, 100:157} 되도록 하여 4일이 지난 후에 질소원 NaN6를 멸균된 증류수 200ml 에 녹여 60 mL/min으로 토양컬럼에 첚가하면서 디젤유의 분해양상과 미생물 생장을 관찰하였다.
- 액체배지에서외 디젤유 분해능 결과를 바탕으로 그 분해능 이 타균주에 비해 우수했던 WY균주를 이용하여 토양에 오 염된 디젤유의 분해에 사용하였다. 먼저 균주를 포함하지 않은 토양컬럼의 경우 10일간 대략 33%의 디젤유가 분해됨을 알 추 있었다{data not shown).
- 영양소의 첨가가 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 배양액에 각각 질소원과 인원을 첨가하여 그 분해능을 첨가 하였다. 사용된 질소원은 MSM의 질소원인 NaNCh 였으며 그 첨가량은 1~20 mM이였다.
- 유류 오염지역으로부터 분리한 미생물 균주들음 KCCM (Korean culture collection of microorganism)에 동징을 위한 지방산 분석을 의뢰하였다. W균주와 Y균주의 Gas chromatography 를 이용한 fatty acid component의 분석결과를 Table 2이] 나타내었다.
- 유류로 오염되어있는 지역의 토양 시료를 채취한 후, 디젤 을 분해할 수 있는 균주를 분리하였다. 분리방법은 우선 토 양 시료를 증류수에 풀어 nutrient 배지 (beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L) 에 도말하여 가능한 모든 콜로니를 분리하여 각각 배양하였다.
- 2 呻 filter로 여과한 후 사용하였다- 위에서 얻은 균주들을 3차례 계대배 양한 후 디젤 분해능이 좋은 2종류의 균주를 분리하였다. 이 들은 평판 배양시 각각 백색의 콜로니와 황색의 콜로니를 형 성하였으며 이에 따라 백색 콜로니를 형성하는 균주, 황색 콜로니를 형성하는 균주, 그리고 두 균주를 혼합하여 배양하여 얻은 균주를 각각 W균주(while colony strain), Y균주(yellow colony strain), WY균주(white and yellow colony strain)로 명 명하였고 KCCM(Korean culture collection of microorganisms) 에 균주의 동정음위한 지방산 분석음 의뢰하였다.
- 일반적으료 호기성 미생물에게 공기의 공급은 미생물 성장 에 중요한 인자임을 감안하여 공기의 공급속도를 조절하며 디젤유의 분해양상 및 미생물 생장을 관찰하였디Column 1은 전혀 통기를 시키지 않았고 colunin 2, 3, 4에는 각각 10 mL/min, 30 mL/min, 50 mL/inin의 유속으로 컬럼에 공기 를 공급하였다.
- 균주의 양이 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 각각의 균주의 접종량을 달리하여 그 분해능을 측정하였다. 접종 량을 각각 0.5%, 1%, 2%, 4%로 하여 1%의 디젤유를 포함하는 MSM에서 10일간 배양하였다.
- 실험에 사용된 토양은 US sieve 12로 체를 친 것과 US sieve 30으로 체를 친 것을 같은 실량으로 섞어 시용하였다. 준비된 토양시료 0.9 kg을 3회의 멸균과정을 거쳐 9, 000 mg 의 디젤유로 골고루 오염시켰고, nutrient broth에서 배양된 W 균주와 Y균주를 원심분리 후 각각 50 mL의 멸균된 증류수 에 현탁하여 오염된 토양시료에 골고루 주입 후 혼합하여 컬 럼에 충진시켰다.
- 질소와 인이 디젤유의 분해능에 미치는 영향을 검토하기위하여 MSM에 포함되어있는 질소원인 NaNCh와 인원인 KH2PO4를 각각 농도별로 첨가하여 혼합 균주의 분해능을 측 정하였다(Table 3). 질소원인 NaNQ, 의 천가로 분해능이 90% 이상 증가하여 높은 분해 효율을 보인반면, KHzPS의 첨가 는 분해능에 거의 영향을 미치지 못하였다.
- 토양시료를 증류수 10 mL과 충분히 교반 후 1 mL 의 HC1 을 첨가하였다. 충분히 교반된 시료를 filtering을 한 후 UV-visible spectrophotonieter(Shimadzu UV-1601)를 이용하여 270 nm에서의 분석 값으로 보정된 220 mn에서의 분석 값으로 잔류 질소량(NaNCh)을 측정하였다.
- 선별된 우수 균주를 이용하여 토양에서의 디젤유 분해능을 알아보기 위해 토양컬럼을 제작하였다(Figure 1). 컬럼은 다른 연구(8)를 기초로 총 4개의 컬럼을 제작 사용하였으며, 각 컬럼의 총 부피는 대략 2 L이었디..
- 토양시료로 부터의 잔류 디젤유의 추출은 EPA method 3550 (9, 10)방법을 변형하여 사용하였다. 토양시료 2 g에 무 수황산나트륨 2 g과 핵산 5 mL을 첨가한 후 I분간 강력하게 교반한 후 3분간 sonication을 한 후 卫 상등액을 GC를 이용하여 TPH분석을 히-였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 균주는 유류에 오염된 지역의 토양시료 로부터 직접 분리하였는데 본 실험에서는 백색 콜로니를 형 성하는 W균주와 황색 콜로니를 형성하는 Y균주 그리고 두 균주의 복합균주인 WY균주를 사용하였다. 단일 균주보다는 복합균주를 사용하였을 때 디젤유의 분해가 더 효과적이었으 며 질소원의 첨가가 분해에 제한인자로 작용하였다.
- . 본 연구에 사용된 컬럼에 는 컬럼과 덮게사이가 고분자 물질로 sealing되어 있어 공기 및 물의 누출이 방지되며, 컬럼의 아래와 위에는 영영얌류 용액과 공기의 inlet과 outlet이 설치되어 있으며 컬럼내 토양 시료 채취를 위해 덮개부분에 6개의 sampling port가 설치되어 있다.
- 사용된 질소원은 MSM의 질소원인 NaNCh 였으며 그 첨가량은 1~20 mM이였다. 사용된 인원 역시 MSM의 인원 인 KHePQ였으며 그 첨가량은 0.0062-0.124 mM이였다. 1% 의 디젤유를 포함하는 MSM에 2%의 균주를 접종하여 10일 간 n.
- 영양소의 첨가가 분해능에 미치는 영향을 고찰하기 위해 배양액에 각각 질소원과 인원을 첨가하여 그 분해능을 첨가 하였다. 사용된 질소원은 MSM의 질소원인 NaNCh 였으며 그 첨가량은 1~20 mM이였다. 사용된 인원 역시 MSM의 인원 인 KHePQ였으며 그 첨가량은 0.
- 실험에 사용된 토양은 인하데학교 운동장 훍을 30 cm 깊 이에서 채취하였으며, US sieve 12(10 mesh)와 US sieve 30(28 mesh)를 이용하여 고르게 체를 쳐 각기 다른 크기의 입자로 준비하였다. 실험에 사용된 균주는 앞서 선별된 균주 중 복합균주인 WY균주였으며, 대상 유류는 역시 디젤유를 filtering하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 토양은 US sieve 12로 체를 친 것과 US sieve 30으로 체를 친 것을 같은 실량으로 섞어 시용하였다. 준비된 토양시료 0.
- 실험에 사용된 토양은 인하데학교 운동장 훍을 30 cm 깊 이에서 채취하였으며, US sieve 12(10 mesh)와 US sieve 30(28 mesh)를 이용하여 고르게 체를 쳐 각기 다른 크기의 입자로 준비하였다. 실험에 사용된 균주는 앞서 선별된 균주 중 복합균주인 WY균주였으며, 대상 유류는 역시 디젤유를 filtering하여 사용하였다.
- 토양의 sampling에는 내경 1 cm, 길이 20 cm에 중간에 10 cm 가량이 파인 sampler를 사용하였다. 토양시료는 컬럼내 토양 의 5 cm 깊이에서 채취되었으며, 6개의 다른 sampling port로 부터 채취된 시료는 골고루 섞은 후 분석에 사용하였다.
- 토양의 sampling에는 내경 1 cm, 길이 20 cm에 중간에 10 cm 가량이 파인 sampler를 사용하였다. 토양시료는 컬럼내 토양 의 5 cm 깊이에서 채취되었으며, 6개의 다른 sampling port로 부터 채취된 시료는 골고루 섞은 후 분석에 사용하였다.
이론/모형
- 25 pm film thickness)-g- 사용하였다. Normal hexane으로 추 츨한 후 GC를 통해 분리된 디젤유의 탄화수소의 총량은 total petroleum hydrocarbon(TPH)방법으로 정량하였다.
- 잔류 디젤유의 분석은 EPA method 8015를 따라 행하였다(7). Gas chromatography(Shimadzu GC-17A)를 사용하였으며 GC 컬럼으로는 HP-5 capillaiy column(30 m, 0.
- 잔류 질소원의 분석은 Lenore 등(11)의 NQ」분석법을 사용하였다. 토양시료를 증류수 10 mL과 충분히 교반 후 1 mL 의 HC1 을 첨가하였다.
성능/효과
- MSM 배지에 포함되는 디젤유의 농도에 변화를 추어 미생 물의 생장 및 디젤유 분해능에 미치는 영향을 알아보았다. Figure 4에서 알 수 있듯이 0.5%와 1%의 디젤유 농도에서는 그 분해능이 약 70% 이상으로 일정하였으니, , 2%와 4%의 디 젤유 농도에서는 그 분해능이 감소함을 알 수 있는데 특히 4%의 디젤유 농도에서 WY균주의 디젤유 분해능은 약 56% 로 그 분해능이 크게 감소하였다. 휘밭로 감소되는 디젤유가 대략 45%임을 감안할 때 미생물에 의한 분해량은 극히 미비 함을 말한다.
- 각각의 균추를 nutrient 베지에서 36시간 배양한 결과 백색 콜로니를 형성하는 균주와 혼함균주가 황섹 골로니를 형성하는 균주 보다 훨씬 성장속도가 높았다. 각각의 균주가 대수 기 말기에 도달하였을 떼 디젤유를 l%(v/v) 포함하는 MSM에 비지의 2%를 접종하여 25℃, 200 rpm에서 1주일간 배양 한 결과, 세 가지 경우 모두 약 5일 이후에는 세포 수에 있어서 큰 변화가 없었고, 최대 세포 수는 nutrient배지에시의 세포수의 약 30% 정도였다
- 각각의 균추를 nutrient 베지에서 36시간 배양한 결과 백색 콜로니를 형성하는 균주와 혼함균주가 황섹 골로니를 형성하는 균주 보다 훨씬 성장속도가 높았다. 각각의 균주가 대수 기 말기에 도달하였을 떼 디젤유를 l%(v/v) 포함하는 MSM에 비지의 2%를 접종하여 25℃, 200 rpm에서 1주일간 배양 한 결과, 세 가지 경우 모두 약 5일 이후에는 세포 수에 있어서 큰 변화가 없었고, 최대 세포 수는 nutrient배지에시의 세포수의 약 30% 정도였다
- 결과를 보면 약 2% 정도의 접종량으로 배지에 포함된 디젤 유가 거의 분해될 것으로 생각되는데, 그 이상의 접종량에서 그 분헤성도가 크게 증가하지 않는 것은 약 75% 정도의 디 젤유가 감소한 후의 잔류 디젤유에는 사용된 미생물이 분해 하기 어려운 난분해성 물질들이 대부분일 것이기 때문으로 생각된다.
- 질소원을 전혀 첨가해주지 않았을 경우(column 1) 앞선 통기 조건 실험에서와 같이 60% 정도의 디젤유 분해능을 보였으나, 질소원을 100:10의 질량비(column 3)로 첨가해준 경우 10일 후 70%의 디젤분해능을 나타내었다(Figure 6). 미생물의 수는 질 소원을 첨가한 후 2일 정도 후부터 증가하여 질소원이 첨가 안된 경우와 비교 더 많은 수의 생균수가 유지되어 미생물의 생장과 질소원의 공급은 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
- 단일 균주보다는 복합균주를 사용하였을 때 디젤유의 분해가 더 효과적이었으 며 질소원의 첨가가 분해에 제한인자로 작용하였다. 비록 도 양시스템에서의 분해효율은 액체상에서의 분해능에 비해 다소 떨어지지만, 통기의 조건 및 질소원의 첨가등으로 St 능 력을 어느 정도 향상시킬 수 있었다. 한편 디젤유의 분해에 는 생물학적인 측면 뿐 아니라 증발이나 휘발에 의해서도 상 당량 감소하였는데 교반에 의해 또 오염토양의 제조공정중에 상당량이 휘발하는 것으로 보이며, 디젤의 용해도가 낮기 때문에 침출되는 양도 적을 것이라고 보여지고 이는 다른 논문 에서도 보고된 바 있다(21, 22).
- 균주의 접종량을 달리하여 각각의 디젤유 분헤정도를 측정하였다. 약 2일간 배양하였을 떼 Figui-e 3에서와 같이 접종 량을 4%로 하였음 때 WY균주의 경우 약 78%의 디젤유가 감소되어 0.5%의 접종량에서 약 55%의 갂소량보다 그 분해 정도가 컸다 그러나 접종량이 1%일 때 디젤유의 감소량이 0.5% 접종량에서의 감소량보다 급격히 증가한 반면 2%, 4% 로 증가되면서 그 분해정도는 크게 증가하지는 않았다.
- 균주의 접종이 없는 경우 10, 000 ppm의 디젤유로 오염된 토양은 10일 후 오염양의 약 33%가 감소한 반면 같은 조건하에서 균주를 투입한 경우 약 50%의 디젤유가 분해되었다. 온도가 상온(25℃~29℃)으로 거의 일정하여 디젤유외 분해에 큰 영향을 주지 않았음{15, 16) 을 감안할 때 토양내에서도 투입된 미생물이 디젤유 분해능 을 가진다는 것을 알 수 있었다. 이는 주입된 미생물이 토양 컬럼안에서 디젤유를 효과적으로 분해하는데 적어도 30 mL/min 유속 이상의 통기가 효과적임을 나타내며 일반적인 연구 결과(15, 17)에도 통기가 없음 경우 그 분해능이 급속히 떨어진 다고 보고되어 있다.
- S Environmental Protection Agency(18)에서는 C:N외 비를 10:1~100:1로 하여 bioremediation에 적용하길 권고하고 있으니-, 몇몇 연구졀과에 서는 100:10(19) 또는 100:5(20)가 최적이라고 보고되기도 하였다. 이렇데 다양한 결과는 사용된 균주의 특성 및 사용된 토양의 특성 등에 의한 것으로 볼 수 있는데 이러한 연구 졀 과를 기초로한 본 실험에서는 질소원이 추가로 첨가된 경우 약 70%의 분해윤을 보여 짊소원이 천가 안된 경우와 비교하여 효과적임을 알 수 있었으며 질소원의 천가가 미생물의 셍 장과 디젤유의 분해능을 촉진함을 알 수 있었다.
후속연구
- 그러나 토양 생태계는 매우 복잡하며 유기화합물의 거동은 토양화학, 토양물리학 및 투양미셍물의 함수이다(5). 따라서 토양 시스템에서의 유류의 거동 및 제거 는 많은 요소들에 의해 의존할 것이며, 이런 주요한 요소의 상호효과에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 한편 디젤유의 분해에 는 생물학적인 측면 뿐 아니라 증발이나 휘발에 의해서도 상 당량 감소하였는데 교반에 의해 또 오염토양의 제조공정중에 상당량이 휘발하는 것으로 보이며, 디젤의 용해도가 낮기 때문에 침출되는 양도 적을 것이라고 보여지고 이는 다른 논문 에서도 보고된 바 있다(21, 22). 앞서 언급한 것처럼 본 실험 에서는 통기와 질소원의 첨가를 통헤 미생물에 의한 디젤유 의 분해능을 향상시켰는데, 이 뿐만 아니라 더욱 효과적인 디젤유외 분해를 위해서는 복잡한 토양시스템에 관계된 여러 요소들을 최적화 하여 분해능을 향상시키기 위한 실험이 수 행되어야 한다.
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