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문제 정의
- anthracis ATCC 14578의 pagA 유전자의 DNA 염기서열을 밝히고、기존에 보고된 국외의 pagA 유전자 DNA 염기 및 아미노산 서열 등과 비교 분석함으로서 국내에서 발견 되어진 탄저균에서의 변이를 확인하고자 하였다. 또한 얻어진 pagA의 염기서열을 통하여 탄저균을 계통분류학적으로 분석하고자 하였으며, pagA의 변이를 토대로 탄저균을 유전자형과 표현형으로 분류하고자 하였다.
- 본 연구에서는 국내 홍성과 경주에서 각각 분리한 B. anthracis BAK 와 B. anthracis BAH, 그리고 B. anthracis ATCC 14185와 B. anthracis ATCC 14578의 pagA 유전자의 DNA 염기서열을 밝히고、기존에 보고된 국외의 pagA 유전자 DNA 염기 및 아미노산 서열 등과 비교 분석함으로서 국내에서 발견 되어진 탄저균에서의 변이를 확인하고자 하였다. 또한 얻어진 pagA의 염기서열을 통하여 탄저균을 계통분류학적으로 분석하고자 하였으며, pagA의 변이를 토대로 탄저균을 유전자형과 표현형으로 분류하고자 하였다.
- 탄저균의 pagA 유전자를 이용하여 탄저균들의 유전적 변이와 다양성을 조사하고자 하였다. 한국에서 발견된 B.
제안 방법
- 16). 16S RNA 염기서열분석과 16S와 23S rDNAs 또는 gyrA와 gyrB 유전자 사이의 염기서열 분석을 통하여 탄저균의 DNA의 분자적 분석이 이루어졌다(5). 1995년 Henderson 등⑹은 18종의 제한효소를 이용한 밴드양상과, arbitrary primer (8~ 10 bp)를 이용한 PCR을 통하여 Bacillus속에서 탄저균 35 균주를 분류하였다.
- Oligonucleotide primer는 pXOl 플라스미드 염기서열의 pagA 유전자(GenBank accession No. M22598)를 대상으로 ClonTech 회사의 프로그램 (primer detective Ver. 1.01)을 사용하여 고안하였다. 필요한 primer는 제노텍(GenoTech, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.
- 최종적으로 72℃에서 8 분간 반응시켰다. PCR 산물의확인은 Tris-acetate (TAE) 완충액을 사용하여 1.5% agarose gel 전기영동을 행한 후, 관찰하였다.
- Table 1에서 보여진 변이가 일어난 8 부위 중 다양한 탄저균에서 변이가 나타난 4, 5, 6번째 염기서열부위의 아미노산을 기준으로 pagA에서의 표현형을 결정하여 탄저균을 분류하였다. 즉, 변이 빈도수가 높은 4, 5, 6번째의 변이 염기를 아미노산으로 나타낸 후, 아미노산을 한 개 글자로 표기하여 3개의 아미노산을 가지고 표현형을 나타냈다.
- Table 2에서 보여진 결과처럼 pagA 유전자에서 변이가 일어난 염기서열을 토대로 10가지 그룹으로 pagA의 유전자형을 결정하여 탄저균을 분류하였다. 즉 pagA에서 변이가 일어난 8 부위(Fig.
- pagA 유전자를 얻기 위한 탄저균의 total DNA 분리는 Hunter의 방법(7)을 약간 변형하여 사용하였다. 즉, 각각의 B.
- 2). 그리고 AF306783, AF306781, AF306780 및 AF306779는 Price등(14)이 탄저균의 다양성 분석에 사용한 B. anthracis BA1024, 33, BA1035 및 28균주의 pagA 유전자 염기서열을 비교하였다 (Table 3).
- 본 연구에서는 Price 등(14)의 연구 결과를 근거로 하여 한국에서 발견된 B. anthracis BAK와 B. anthracis BAH 그리고 B. anthracis ATCC14185 및 B. anthracis ATCC14578의 2,294 bp 의 pag 유전자의 DNA 염기서열을 분석한 후, 기존의 밝혀진 탄저균 26균주와 비교 분석하여 표현형과 유전자형으로 탄저균을 분류하였다.
- 1% Triton x-100)은 사전에 준비하고 분주하여 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다. 분주된 PCR 용액에 1U ExTaq DNA 중합 효소와 주형 DNA로 50 ng의 주형 DNA를 넣고, 대조군은 주형 DNA가 없는 증류수만을 각각 넣은 후, DNA thermal cycler TC-1 (Perkin-Elmer Co.)을 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
- )를 이용하여 정제한 후, (주)Solgent에 의뢰하여 분석하였다. 염기서열분석은 capillary방식의 ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Perkin-Elmer Co.)를 사용하였으며 분석에 사용된 sequencing kit는 ddNTP 에 형광물질 lable방식인 Bigdye terminator cycle sequencing ready reaction kit를 사용하였으며, 반응조건은 PCR reaction; 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분(25 cycle)로 하였다. 반응 후, sequencing 반응에 참여하지 않는 형광물질로 lable된 ddNTP 제거는 DyeEX kit (QIAGEN Co.
- 분류하였다. 즉 pagA에서 변이가 일어난 8 부위(Fig. 3)를 중복이 되지 않게 배열하여 분류하였다(Table 2). B.
- 탄저균의 계통발생학적 분석을 위하여 본 실험에서 얻은 B. anthracis BAK, B. anthracis BAH, B. anthracis ATCC14185 및 B. anthracis ATCC 14578 의 pagA 유전자 염기서열(Fig. 1)과 기존의 NCBI GenBank database 의 AF268967, AF306783, AF306782, AF306781, AF306780, AF306779 및 AF306778 에 보고된 B. anthracis의 pagA 유전자의 염기서열(자료생략)은 Multalin version 5.4.1 프로그램을 사용하여 분석하였다(Fig. 2). 그리고 AF306783, AF306781, AF306780 및 AF306779는 Price등(14)이 탄저균의 다양성 분석에 사용한 B.
- 조사하고자 하였다. 한국에서 발견된 B. anthracis BAK와 B. anthracis BAH 그리고 B. anthracis ATCC14185 및 B. anthracis ATCC14578의 pagA 유전자의 DNA 염기서열을 분석한 후(Fig. 1). BLAST 프로그램을 사용하여 기존에 밝혀진 염기서열과 비교 분석하였다(Fig.
- 확인되어진 PCR 산물은 QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Co.)를 이용하여 정제한 후, (주)Solgent에 의뢰하여 분석하였다. 염기서열분석은 capillary방식의 ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Perkin-Elmer Co.
대상 데이터
- anthracis ATCCI4185. B. anthracis ATCC 14578, 등은 수의과학검역원 (VRI, RDA, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 일반적인 탄저균의 배양조건은 조 등(2)이 사용한 방법에 따라 brain heart infusion (BHI, Difco Co.) 배지와 한천평판배지에 접종하고 37℃에서 18〜20시간 진탕(100 rpm) 또는 정체 배양하였다.
- gov/entrez) accession no. M22589를 이용하였으며, 염기서열 변이를 표시한 번호는 이를 근거로 하였다(Table 1). 얻어진 결과는 B.
- 탄저균의 pagA 다양성 분석에 사용한 균주는 한국 경주와 홍성에서 발견된 탄저균 (BAK 와 BAH) 과, B. anthracis ATCCI4185. B.
데이터처리
- 1). BLAST 프로그램을 사용하여 기존에 밝혀진 염기서열과 비교 분석하였다(Fig. 2). 그리고 Price 등(14)이 분석하여 얻은 pagA 유전자 염기서열과 비교하여 유전적 변이를 분석하였다.
- 사용된 각각의 primer의 염기서열의 uptream은 5'- GAAGTTAAACAGGAGAAC-3', downstream은 5'-TTATCCTAT- CTCATAGCCTTT-3 이었다. 얻어진 primer 염기서열은 BLAST 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 이용하여 순수하게 각각의 원하는 DNA 절편만을 얻을 수 있는 가를 검증하였다.
- 얻어진 염기서열 결과는 Multalin version 5.4.1 프로그램을 이용하여 아미노산 염기서열을 결정한 후 비교 분석하였고, PA의 단백질 3차 구조는 이미 밝혀져 있는 NCBI Entrez 3D database (MMDB no. 6980) (13)를 이용하여 분석하였다.
- 유전자 염기서열 분석에 의하여 얻은 염기서열은 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 이용하여 기존에 밝혀진 염기서열과 비교 분석하였다. 계통분류학적인 분석(cladistic analysis)은 Multalin version 5.
이론/모형
- gov/blast)을 이용하여 기존에 밝혀진 염기서열과 비교 분석하였다. 계통분류학적인 분석(cladistic analysis)은 Multalin version 5.4.1 (copyright I.N.R.A., France) 프로그램을 이용하였다.
- 2). 그리고 Price 등(14)이 분석하여 얻은 pagA 유전자 염기서열과 비교하여 유전적 변이를 분석하였다. 분석시 표준 염기서열로 사용한 것은 탄저균 pXOl의 pag 전체 유전자 염기서열(21)을 나타낸 NCBI Entrez (http:// www.
성능/효과
- anthracis BAK의 경우 pag 유전자 3062번째 염기의 점돌연변이가 발생하여 아미노산 600번째의 alanine이 valine으로 변화되었는데, 이러한 구조적 변화로 인해 숙주 내에서 LF와 PA의 결합에 영향을 주는 것으로 보인다(12, 14). B. anthracis BAH 는 type strain 인 B. anthracis ATCC14185와 비교하여 변이가 없는 것으로 분석되었다. Price 등(14)이 한국에서 분리한 B.
- 즉, 변이 빈도수가 높은 4, 5, 6번째의 변이 염기를 아미노산으로 나타낸 후, 아미노산을 한 개 글자로 표기하여 3개의 아미노산을 가지고 표현형을 나타냈다. B. anthracis BAK와 B. anthracis ATCC 14578은 FPV, 그리고 B. anthracis BAH와 B. anthracis ATCC14185는 FPA로 나타났다. Price 등(14)의 결과와 본 실험의 결과로 FPA는 6/30, FPV는 14/30 그리고 FSV는 3/30의 빈도수로 나타났다(Table 2).
- B. anthracis BAK와 B. anthracis BAH 그리고 B. anthracis ATCC14185 및 B. anthracis ATCC14578의 pagA 유전자의 DNA 염기서열(Fig. 1)과 아미노산 분석을 한 결과, B. anthracis BAK에서 pagA의 아미노산서열(NCBI Entrez, accession no. P13423)의 30번(Gl⇒Gln), 600번(Ala⇒Val) 아미노산에서 그리고 B. anthracis ATCC14578는 600번(Ala⇒Val) 아미노산에서 변이가 확인되었다(Table 1). 특히, Price 등(14)의 결과에서 나타나듯 B.
- 계통발생학적으로 B. anthracis ATCC14185와 B. anthracis BAH는 매우 근접되어 있어 유사성이 높으며, B. anthracis 28과 B. anthracis ATCC14578과도 근접한 것으로 나타났다. B.
- M22589를 이용하였으며, 염기서열 변이를 표시한 번호는 이를 근거로 하였다(Table 1). 얻어진 결과는 B. anthracis BAK의 pagA 유전자는 1891(G ⇒C), 1998(C⇒T) 및 3602((C⇒T)번째 염기에 변이가 나타났고, B. anthracis BAH는 변이가 나타나지 않았다. B.
- Price 등(14)은 1997년 Keim 등(8)이 AFLP DNA market를 이용한 변이 연구에서 얻어진 결과를 토대로 탄저균의 염색체의 변이와 플라스미드 변이와의 연관 관계를 밝히고자 pagA 유전자의 DNA 염기서열을 분석하여 탄저균을 계통분류학적으로 분류하였다. 연구 결과, 탄저균에서 염색체 변이가 일어난 균주와 pXOl 플라스미드의 pagA 유전자에서 변이가 발생한 균주와는 연관 관계가 있었다. 이러한 결과를 통해 병원성 요인인 pXOl 플라스미드의 탄저균들에서 수평적 이동은 없다고 보고하였다.
- 탄저균을 표현형으로 분류하였을 경우, Price 등(14)의 결과와 같은 4 그룹으로 나타났고, FPA(9/30)에서 FPV( 16/30)보다 FSV(3/30)으로 변이가 5배 이상 적은 빈도로 발생하였으며 (Table 2), 유전자형은 10 그룹으로 Price 등(14)의 8 그룹보다 많게 분류되었다. 이 결과는 탄저균을 다른 종(species)으로부터 분류시 이용한 16S와 23S rDNA 염기서열 분석(5)과 arbitrary primer를 이용한 PCR과는 탄저균 분류에서 차이가 있으며, Smith 등(17)이 VNTR 분석으로 탄저균을 2 그룹으로 나눈 것보다 다양하게 탄저균을 분류할 수 있다고 판단된다.
- 변이가 일어난 빈도는 1998(21/30), 3602(20/30)번째의 염기에서 가장 높게 나타났다. 이러한 결과를 분석하였을 때 탄저균 PA유전자에있어 domain 1에서 1 부위, domain 2에서 1부위, domain 3에서 5부위에 변이가 일어난 것으로 나타났고, HAR(highly antigenic region)에서 1부위에 변이가 일어난 것으로 나타났다(Fig. 3).
- anthracis F-l 은 missense mutation으로 인해 서로 다른 PA 단백질 구조를 가졌다(Table 3). 이러한 탄저균 PA의 변이 분석은 탄저균 PA에서 missense mutation이 나타난 아미노산과 pag 유전자에서 점돌연변이가 일어난 부위를 기준으로 표현형 및 유전자형으로 탄저균을 분류하는 것이 가능하다고 판단하였다. 탄저균을 표현형으로 분류하였을 경우, Price 등(14)의 결과와 같은 4 그룹으로 나타났고, FPA(9/30)에서 FPV( 16/30)보다 FSV(3/30)으로 변이가 5배 이상 적은 빈도로 발생하였으며 (Table 2), 유전자형은 10 그룹으로 Price 등(14)의 8 그룹보다 많게 분류되었다.
- anthracis BAH 염색체 DNA의 RAPD 분석으로 두 균주의 DNA 밴드 양상의 차이가 있음을 밝힌 것⑴과 비교하였을 경우, 국내에서 발견되어진 탄저균에서 pXOl 플라스미드의 수평적인 이동은 없는 것으로 생각된다. 즉, B. anthracis BAK와 B. anthracis BAH 두 균주의 RAPD 분석을 통하여 genomic DNA 의 차이를 확인하였고, 이들 균주의 pXOl에서 pagA 의 변이를 밝힌 것은 현재까지 발견된 지역에 상관없이 가장 분자생물학적 변이가 없는 것으로 알려진 탄저균에서 변이가 확인한 것이고, 탄저균 간의 플라스미드의 이동은 없다고 판단된다. 더욱이 탄저병원성 요소 중 가장 중요하다고 알려진 PA에서의 변이는 서로간의 병원성 차이를 나타낼 것으로 사료된다.
- 탄저균 30 균주로부터 8 종류의 점돌연변이(point mutation)가 분석되었고, 이들은 4 종류의 missense mutation과 4 종류의 silent mutation이 일어난 것으로 확인되었다(Table 1). Missense mutation은 대부분 LF 결합부위와 highly antigenic region (HAR) 가까이 위치하였다(Fig.
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