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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전자현미경을 이용하여 배양 세포의 세포 표면의 미세 구조적 특성과 세포 표면에 존재하는 GlcNAc 와 NeuNAc 의 분포를 lectin 의 일종인 WGA (wheat germ agglutinins)를 사용하여 확인하고자 하였다. 또한 세포 표면에 존재하는 GlcNAc와 NeuNAc이 섬유아세포의 세포질에서 생성되어 세포 질외로 분비되는 과정을 확인하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 전자현미경을 이용하여 배양 세포의 세포 표면의 미세 구조적 특성과 세포 표면에 존재하는 GlcNAc 와 NeuNAc 의 분포를 lectin 의 일종인 WGA (wheat germ agglutinins)를 사용하여 확인하고자 하였다. 또한 세포 표면에 존재하는 GlcNAc와 NeuNAc이 섬유아세포의 세포질에서 생성되어 세포 질외로 분비되는 과정을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- WGA에 gold complex/}- 표지된 세포들은 2% osuH- um tetroxide 고정액에 1시간 30분 후고정 하였으며 고정된 재료들은 alcohol 과 hexamethyl - disilazane(HMDS)에 탈수시켜 실온에서 건조하였다. 건조된 재료를 Eiko IB-Ⅲ ion coater로 도금한 후 Hitachi S- 2500 주사전자현미경으로 관찰하였다.
- 토끼의 담관조직을 적출하여 PBS에 세척한 후10% 송아지 혈청 (Gibco. USA, 10% fetal bovine serum)0] 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium : 10F-DMEM) 용액에 세척하여 항생제가 첨가된 10F-DMEM 용액에서 1 mm 이하로 세절(chopping)하였다. 세절된 조직은 원심분리용 시험관에 옮겨 3, 000rpm으로 5분간 원심분리하여, 상등액 을 제거하고 침전물에 1ml의 10F-DMEM 용액을 첨가하여 조직 혼탁액을 제작하였다.
- 포매 된 세포들은 ultramicrotome으로 절편을 제작하여 Roth(1985)와 김 등(2000)의 방법에 따라 황금 입자 표지 WGA 복합체를 반응시켰다. 황금입자 표지 WGA 복합체에 반응된 절편은 uranyl acetate4 lead citrate로 이중염색하여 Zeiss EM 109형 투과전자현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 당단백 말단 GlcNAc와 NeuNAc의 분포를 확인하기 위하여 Wheat germ (Triticum 으로부터 분리된 lectin의 일종인 WGA에 황금입자가 표지된 WGA-Gold colloidal particles (15 nm)를 사용하였다.
- 각 종류의 lectin들은 세포막의 당단백 말단기의 종류에 따라 제각기 특이하게 반응하는 특성을 지니고 있다(Damjanov, 1987). 본 실험에서 사용된 lectin의 일종인 WGA (wheat germ agglutinins) 는 세포막의 GlcNAc (N-acetylgalactosamine)과 NeuNAc (N-acetyl neuraminic acid)<H] 특이적인 반응 을 하는 물질인 것으로 알려졌다 (Murrell, 1974; Wilson & Bames, 1977; Simpson & Smithers, 1980). GlcNAc와 NeuNAc 은' 하등동물 Schistosoma japo- 과 Paragonimus ohiraiee 표피와 맹관 상피표면에 존재하여 숙주의 조직사이로 이동할 때 숙주의 면역계로부터 자신을 방어하여 생존하는데 중요한 역할을 하는 물질인 것으로 추측한 보고를 한 바 있다.
- 중량이 2 kg 인 실험토끼의 담관 조직으로부터 분리된 섬유아세포를 25 ml 배양용기에서 72시간 배양하여 실험 재료로 사용하였다.
이론/모형
- 배양된 섬유아세포는 1% paraformaldehyede)- 1% glutaraldehyde 고정액 (pH 7.4)에 2시간 전고정하고 Roth (1987)와 김 등 (2000)의 방법에 따라 lectin의 일종인 WGA (wheat germ a*]] gglutinins) 황금입자가 표지된 WGA를 반응시키고 0.12 M cacodylate buffer (pH 7.4)에서 세척하였다.
- 2)과 2% osmi- um tetroxide 고정액으로 고정하여 한천으로 전포매 후 ethanol 탈수 후에 Lowicryl HM 20으로 포매하였다. 포매 된 세포들은 ultramicrotome으로 절편을 제작하여 Roth(1985)와 김 등(2000)의 방법에 따라 황금 입자 표지 WGA 복합체를 반응시켰다. 황금입자 표지 WGA 복합체에 반응된 절편은 uranyl acetate4 lead citrate로 이중염색하여 Zeiss EM 109형 투과전자현미경으로 관찰하였다.
성능/효과
- 세포의 핵 주위에는 조면소포체 (RER)가 다양한 형태로 발달되어 있었으며 소포체의 형태는 조면소포체 내강의 팽창 정도에 의하여 형태가 결정 됨이 확인되었다.24시간 배양한 배양섬유세포들은 조면소포체 주위에는 세포질 액포 (cytoplasmic vesicle) 와 세포질 공포 (cytoplasmic vacuole)가 관찰되 었 으며 세포질 액포에는 lectin 황금 입자가 0.1 μm2에 47±5개로 관찰되어 세포 표면에 존재하는 lectin (WGA) 수용체인 Glc NAc (N-acetylgalactosamine)과 Neu NAc(N-acetyl neuraminic acid)/]- 세포질에서 생성되어 세포질 액포에 저장된 것으로 관찰되었다(Fig. 5).
- 72시간 이상 배양한 섬유세포에 lectin 황금입자 복합체를 반응시켰을 때 세포질에는 조면 소포체 내강이 팽대해 있었으며, 세포질 액포들은 세포의 표면으로 이동되어 있는 것으로 관찰되었다. 일부의 액포들은 세포막이 파괴되어 액포의 내용물이 세포외로 분비되는 것으로도 관찰되었다.
- Lectin WGA 에 반응된 배양섬유세포는 대조군 섬유세포에 비하여 세포 표면에 황금입자로 확인된 이 물질이 많이 형성된 것으로 관찰되었으며 세포질 돌 기는 대조군의 세포와 유사하게 잘 발달된 형태로 관찰되었다. 배양시간이 경과할수록 세포 돌기들은 상호간에 중첩되어 관찰되기도 하였다(Fig.
- Schmidt (1988)는 Hymeno- /epis microstoma에서 표피의 microtritches에 lectin수 용체인 GlcNAc와 NeuNAc가 분포하여 숙주로부터 충체 내로 영양물질을 흡수하는데 있어서 세포막 투과성에 관여 한다고 했다. 따라서 lectin 수용체인 GlcNAc와 NeuNAc는 동물 조직의 여러 세포에 존재하여 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려졌다.
- 섬유세포의 배양시간이 경과 될수록 세 포표면의 세포돌기들에 lectin WGA 수용체는 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서 섬유세포의 경우 lectin WGA 수용체는 섬유세포의 세 포배 양초기에 세 포질의 조면소포체 에서 형성되어 조면소포체 의 내강이 lectin WGA 수용체 의 양적 축적으로 팽대하여 액포를 형성하고 lectin WGA 수용체를 포함하는 액포들은 일정 시간이 경과되면 세포표면으로 이동되어 세포 외로 분비되는 것으로 생각되었다. 세포 외로 분비 된 lectin WGA 수용체들은 세포의 배양시간이 경과 될수록 그 양이 증가하게 되고 증가된 lectin WGA 수용체들은 섬유세포의 표면에 다양하게 분포하는 것으로 생각 되었다.
- 따라서 섬유세포의 세포 표면에 분포하는 lectin (WGA) 수용체인 GlcNAc (N-acetylgalactosamine)과 NeuNAc (N-acetyl neuraminic acid)은 세포질의 조면소포체에서 생성되어 조면소포체의 내강의 팽대로 세포질에서 액포 상태로 저장, 이동하여 세포외로 분비된 다음 세포 표면에 분포하는 것으로 확인되었다.
- 뿐만 아니라 배양시간이 경과할수록 세포 돌기들이 중첩되어 관찰되는 것을 보아 세포돌기들은 다양한 형태의 돌기다발을 이루게 되는 것으로 생각되었다. 또 24시간 배양에서 72시간 배양으로 갈수록 세포 미세 융모를 포함하는 세포돌기들이 더 많이 관찰된 것으로 보아 섬유세포 배양시 actin 섬유로 구성된 세포 돌기가 세포질에서 세포표면 쪽으로 확장되어 세포의 부착에 영향을 미칠 것이며, 세포의 이동에도 관여 할 것으로 생각되었다.
- 본 실험의 주사전자현미경관찰에서 세포 표면에 황금표지 lectin WGA를 반응시키고 관찰한 바 섬유세포 의 표면에 황금입자가 표지된 것이 관찰되어 섬유세포의 표면에 많은 양의 lectin WGA 수용체인 당 단백질 말단의 일종인 sialic acid 즉 GlcNAc과 NeuNAc가존재함을 알 수 있었다. 또한 세포배양 초기보다 세포배양 시간이 경과 될수록 섬유세포 표면에 더 높은 밀도의 황금입자 표지 lectin WGA7} 반응되어 황금입자의 표지가 관찰되는 것으로 보아 세포배양 시간이 경과 될수록 세포 표면에 lectin WGA 수용체가 더 많이 생성되어 세포의 이동과 증식 그리고 세포 막의 물질인식에 관여하는 기능적 역할이 증가하는 것으로 생각되었다.
- 본 실험의 주사전자현미경관찰에서 세포 표면에 황금표지 lectin WGA를 반응시키고 관찰한 바 섬유세포 의 표면에 황금입자가 표지된 것이 관찰되어 섬유세포의 표면에 많은 양의 lectin WGA 수용체인 당 단백질 말단의 일종인 sialic acid 즉 GlcNAc과 NeuNAc가존재함을 알 수 있었다. 또한 세포배양 초기보다 세포배양 시간이 경과 될수록 섬유세포 표면에 더 높은 밀도의 황금입자 표지 lectin WGA7} 반응되어 황금입자의 표지가 관찰되는 것으로 보아 세포배양 시간이 경과 될수록 세포 표면에 lectin WGA 수용체가 더 많이 생성되어 세포의 이동과 증식 그리고 세포 막의 물질인식에 관여하는 기능적 역할이 증가하는 것으로 생각되었다.
- 섬유세포에 황금표지 lectin WGA를 반응시키고 투과전자현미경으로 관찰한 바 섬유세포의 배양 초기 에는 lectin WGA 황금 입자가 세포질의 조면소포체 부근에서 관찰되어 세포질의 액포를 형성하고 있는 것으로 관찰되었으며, 세포배양시간이 경과된 세포에서는 세포질의 lectin WGA 수용체를 포함하는 액포들이 세포의 표면 쪽으로 이동된 것으로 관찰되었다. 세포표면으로 이동된 액포들은 세포 외로 액포의 함 유물인 lectin WGA 수용체를 분비하고 있는 것으로 관찰되었다.
- 세포표면으로 이동된 액포들은 세포 외로 액포의 함 유물인 lectin WGA 수용체를 분비하고 있는 것으로 관찰되었다. 섬유세포의 배양시간이 경과 될수록 세 포표면의 세포돌기들에 lectin WGA 수용체는 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서 섬유세포의 경우 lectin WGA 수용체는 섬유세포의 세 포배 양초기에 세 포질의 조면소포체 에서 형성되어 조면소포체 의 내강이 lectin WGA 수용체 의 양적 축적으로 팽대하여 액포를 형성하고 lectin WGA 수용체를 포함하는 액포들은 일정 시간이 경과되면 세포표면으로 이동되어 세포 외로 분비되는 것으로 생각되었다.
- 섬유세포의 세포질 돌기의 표면은 돌기의 형성 정도에 따라 황금입자의 표지 정도가 부분적으로 다소 상이하였으나 일정 시간 성숙한 세포 돌기는 동일한 밀도의 황금 입자가 표지된 것으로 관찰되어 세포 돌기 표면의 lectin (WGA) 수용체 분포도 섬유세포 표면과 유사한 것으로 확인되었다(Figs. 3, 4).
- 섬유세포의 세포표면에 분포하는 당 단백질 말단의 일종으로 섬유세포의 이동과 세포인식에 관여하는 lectin WGA 수용체인 sialic acid (GlcNAc; N-acetylgalactosamine, NeuNAc; N-acetyl neuraminic acid)는 세포질의 조면소포체에서 생성되어 액포상태로 이동되어 섬유세포의 외로 분비되고 분비된 sialic acid는 세포의 표면과 돌기의 표면에 당 단백질 말단으로 분화하여 섬유세포의 이동과 세포인식 등의 세포기능에 관여하는 것으로 사료된다.
- 일부의 액포들은 세포막이 파괴되어 액포의 내용물이 세포외로 분비되는 것으로도 관찰되었다. 세포외로 분비되는 액포의 내용물에는 황금입자가 22±3개가 표지되어 세포질 액포 내용물이 lectin (WGA) 수용체인 GlcNAc (N- acetylgalcosamine)과 NeuNAc (N-acetyl neuraminic acid)인 것으로 확인되었다(Fig. 6).
- 부분적인 세포돌기에는 Ipim의 미세 융모들이 세포표면에 발달되어 있음이 관찰되었다.세포의 핵 주위에는 조면소포체 (RER)가 다양한 형태로 발달되어 있었으며 소포체의 형태는 조면소포체 내강의 팽창 정도에 의하여 형태가 결정 됨이 확인되었다.24시간 배양한 배양섬유세포들은 조면소포체 주위에는 세포질 액포 (cytoplasmic vesicle) 와 세포질 공포 (cytoplasmic vacuole)가 관찰되 었 으며 세포질 액포에는 lectin 황금 입자가 0.
- 이상의 결과로 섬유세포의 표면에 미세구조적 특성은 세포의 분화 정도와 세포의 부위에 따라 다양한 형태를 형성하며, 세포의 배양시간에 따라 정도의 차이는 있으나 일반적인 미세융모의 분포와 세포질 돌기의 분화는 세포의 주위 환경에 따라 다양한 형태로 분화하는 특성이 있는 것으로 생각되었다.
- 2). 주사 전자현미경 고배율 관찰에서 섬유세포의 표면은 세포의 성숙시기에 따라 다소의 차이는 있으나 0.1μm2에 15 ±2개의 황금입자가 관찰되어 lectin (WGA) 수용체인 GlcNAc (N-acetylgalactosamine)과 NeuNAc (N-acetyl neuraminic acid)이 분포하고 있음이 확인 되었다(Figs. 3, 4).
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