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문제 정의
- 김 가수분해물로부터 ACE 저해 물질을 효율적으로 추출하기 위한 조건을 검토하였다. 즉, 김의 주 색소 성분인 chlorophyll 및 phycobilin 등 (이와 김, 1999)을 제거하기 위하여 I 처리구는 김 분말 시료에 10배의 diethylether를 가하여 24시간 방치하였으며, II처리구는 시료에 30배의 증류수를 가하여 98t에서 3시간동안 교반, Ⅲ처리구는 diethylether 처리 후 98t에서 3시간 동안 교반 시킨 후 각각 가수분해하였다.
- (Horovitz, 1981). 본 연구에서는 해조류로부터 ACE 저해능을 가진 기능성 물질 을 분리해 냄으로써 해조 자원의 이용도를 증진시키고 고혈압 억 제 기능을 가진 새로운 식품 소재를 개발하기 위하여 전보 (Lee et al., 1999)의 결과에 따라 ACE 저해 효과가 가장 큰 김의 Maxazyme NNP 가수분해물을 시료로 하여 여러 단계 의 column chromatography 및 reverse-phase(RP)HPLC를 통해 ACE 저해 효과가 큰 단일 peptide를 분리하고, 이의 분자량과 amino acid sequence를 분석하였다.
가설 설정
- a: ICso defined as the concentration of ACE inhibitor required to inhibit 50% of the ACE activity.
제안 방법
- 김 가수분해물을 ultrafiltration하여 얻은 분자량별 분획물 중 ACE 저해 효과가 높은 분자량 3, 000 이하의 저분자 물질을 Sephadex G- 25 column0)] 주입하여 gel filtration chromatography를 행하였다. 0.05M TFA 용액으로 용출한 분획물의 흡광도를 280nm에서 측정 했을 때 Fig. 2와 같았으며, 이 chromatogram을 fraction peak에 따라 4개의 분획으로 나누어 각 분획물의 수율 및 ACE 저해 효과를 측정하였다 (Table 4).
- 5, 50℃의 조건에서 Maxazyme NNP로 8시간 동안 가수분 해한 후 70% e버anol 처리한 상층액으로부터 얻은 김 가수분해 물에서 ACE 저해 물질을 분리, 정제하기 위해 다음과 같이 단계별 column chromatography 및 HPLC (AKTA explorer 100, phar- macia, Sweden)를 행하였다. ACE 저해 물질의 분획은 AKTAexp- lorer 100 (Pharmacia Biotech)을 사용하여 수행하였으며, peptide 성분의 검출은 AKTA explorer 100에 장착된 UV detector를 사용하여 215nm에서 실시하였다.
- 4). Elution volume 80mL까지 S1O2는 3개의 분획으로, S2O 4, S2O5 및 S2O6는 각각 5개의 분획으로 나누어 각 분획물의 ACE 저해 효과를 측정하였다. S1O2의 경우 분리된 3개의 분획물 중 S1O2V2만이 29.
- ODS-AQ column에 의한 분리는 Matsui et al. (1993)의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉, Sephadex G_25 column에 의해 용출된 분획물 중 ACE 저해 효과가 뛰어난 획분의 동결 건조 시료 0.
- Sephadex G_25 column chromatography에서 시료로 선정된 SI 과 S2 분획물로부터 전 단계에서 함께 용출된 염의 제거와 peptide 분획을 동시에 실시할 목적으로 ODS-AQ column을 사용하였다 (Fig. 3).
- Superdex Peptide HR column chromatography에 의해 최종적 으로 분리, 정제된 ACE 저해 peptide 획분들의 분자량은 LC-Elec- trospray Mass Spectrometer (MassLynx, 2.1, Micromass Platform Ⅱ, Manchester, U.K.)를 이용하여 측정하였으며, amino acid se- quence의 분석은 Applied Biosystems 473A Protein Sequencer (Perkin Elmer)를 사용하여 수행하였다.
- Vydac C-18 column에 의해 1차적으로 용출된 획분 중 ACE 저해 효과가 뛰어난 획분을 Vydac C-18 column에 재 주입하였으며, 이 때의 용매 공급은 2 mL/min의 속도로 elution volume 80mL까 지 3% ACN과 0.07% TFA를 함유한 증류수를 일정하게 용줄시켜 2mL씩 분취하여 각각의 획분을 감압 농축하였다.
- Vydac CT8 column chromatography에서 분리된 획분들에 최 종적으로 남아 있는 염 등의 불순물들을 제거하고 각각의 정제 정도를 확인하기 위하여 Superdex Peptide HR column에 의한 gel permeation chromatography를 실시하여 단일 peak (S1O2V2V1P, S1O2V2V2P, S2O6V3V1P, S2O6V4V1P 및 S2O6V4V2P)를 분리하였다.
- Vydac CT8 column에 의한 RP (reverse-phase)-HPLC의 분석 은 용매 조건에 따라 두 단계로 나누어 분리하였다.
- 김 가수분해는 전보 (Lee et al., 1999)의 결과에 따라 김 분말 시료에 30배의 증류수를 가하여 pH 5.5, 50℃의 조건에서 Maxazyme NNP에 의해 8시간 동안 가수분해시켰다.
- 김 가수분해물을 ultrafiltration하여 얻은 분자량별 분획물 중 ACE 저해 효과가 높은 분자량 3, 000 이하의 저분자 물질을 Sephadex G- 25 column0)] 주입하여 gel filtration chromatography를 행하였다. 0.
- 김 분말 시료에 30배의 증류수를 가한 다음, 각각의 단백질 분해 효소를 1% (w/w)의 농도로 첨가하여 각 효소별로 최적의 활성 조건 (Alcalase: pH 7.0, 60℃, bromelain: pH 6.0, 43℃, Colluplin: pH 6.5, 60℃, Esperase: pH 8.0, 60℃, Flavourzyme: pH 7.0, 50t, Maxazyme: pH 5.5, 50℃, Neutrase: pH 6.0, 50℃, papain: pH 6.0, 70℃, Promod 192P: pH 4.5, 50t, Promod 194P: pH 7.0, 50℃, Protamex: pH 6.0, 40℃, Sumizyme MP: pH 8.0, 50℃, Thermoase: pH 8.0, 70S)으로 진탕항온수조에서 각각 4시간 동안 가수분해한 후 원심분리(7, 000Xg, 30분)하여 감압 여과하였다. 이 여액에 20% TCA (trichloroacetic acid)를 가하여 효소 실활 및 잔존 단백질을 침전시킨 후 다시 에서 7, 000Xg로 20분간 원심분리하여 상층 액만을 취하여 ether로써 잔존 TCA를 제거한 후 동결 건조하여 단백질 가수분해 효소 선정 시료로 사용하였다.
- 김 분말 시료에 diethylether 처리 후 Maxazyme NNP에 의해 8시간 동안 가수분해한 다음 70% ethanol 가용성 물질을 동결 건조한 김 가수분해물로부터 ACE 저해 물질을 단계별 column chromatography를 통해 분리, 정제한 결과는 다음과 같았다. 이때 김 가수분해물의 ACE IGoe 150.
- 김 분말 시료에 diethylether 처리 후, 30배의 증류수를 가하고 pH 5.5, 50℃의 조건에서 Maxazyme NNP로 8시간 동안 가수분 해한 후 70% e버anol 처리한 상층액으로부터 얻은 김 가수분해 물에서 ACE 저해 물질을 분리, 정제하기 위해 다음과 같이 단계별 column chromatography 및 HPLC (AKTA explorer 100, phar- macia, Sweden)를 행하였다. ACE 저해 물질의 분획은 AKTAexp- lorer 100 (Pharmacia Biotech)을 사용하여 수행하였으며, peptide 성분의 검출은 AKTA explorer 100에 장착된 UV detector를 사용하여 215nm에서 실시하였다.
- 김의 대부분의 성분을 차지하는 다당류와 고분자 단백질 등을 제거하기 위하여 Maxazyme NNP로 가수분해시킨 김 가수분해물 에 최종 농도가 50~90%가 되도록 ethanol을 가하여 각각의 가 용성 획분과 침전 획분의 ACE 저해 효과와 수율 및 peptide-nitrogen 함량을 비교하였다 (Fig. 1).
- 2%로 가장 높게 나타났다. 김의 효소 가수분해물로부터 ACE 저해peptide만을 효율적으로 분리하기 위한 추출 조건 시험에서, 색소 제거를 위해서는 diethylether 처리가, 다당류 및 고분자 단백질 제거를 위해서는 70% ethanol 처리가 각각 선정되었다. 김가수분해물로부터 ACE 저해peptide를 분리, 정제하기 위한 첫 단계로 ultrafiltration을 한 결과, 분자량 3,000 이하 분획물의 ACE 저해 효과가 69.
- 단계별 column chromatography에 의해 최종적으로 분리, 정제된 ACE 저해 peptide들의 amino acid sequence를 분석하였다 (Table 6).
- 즉, 김의 주 색소 성분인 chlorophyll 및 phycobilin 등 (이와 김, 1999)을 제거하기 위하여 I 처리구는 김 분말 시료에 10배의 diethylether를 가하여 24시간 방치하였으며, II처리구는 시료에 30배의 증류수를 가하여 98t에서 3시간동안 교반, Ⅲ처리구는 diethylether 처리 후 98t에서 3시간 동안 교반 시킨 후 각각 가수분해하였다. 또한 김의 대부분 성분을 차지하는 다당류 및 고분자 단백질 등 (김, 1987)을 제거하기 위하여 김 분 말 시료에 10배의 diethylether로 24시간 처리 후 가수분해한 가수 분해액에 최종 농도가 50, 60, 70, 80 및 90%가 되도록 ethanol을 가하여 24시간 정치시킨 후 원심분리하였다. 상층액은 감압 농축 하고 동결 건조시켜 ethanol 가용성 획분 시료로 하고, 침전물은 소량의 증류수에 용해시켜 동결 건조하여 ethanol 침전 획분 시 료로 하였다.
- 리된 ACE 저해 peptide 획분들(S1O2V2V1P, S1O2V2V2P, S2O6 V3V1P, S2O6V4V1P 및 S2O6V4V2P)의 분자량을 ElectrosprayMass Spectrometer를 이용하여 측정하였다. S1O2V2V1P의 분자량 은 413.
- 본 연구는 김의 Maxazyme NNP 가수분해물로부터 여러 단계의 column chromatography 및 HPLC를 통해 ACE 저해 peptide 를 분리, 정제하여 이의 분자량과 amino acid sequence를 분석하였다. ACE 저해 효과가 큰 저분자 peptide의 함량이 많은 가수분 해물을 얻기 위한 최적의 단백질 가수분해효소를 선정하기 위하여 시험한 결과, Maxazyme NNP에 의한 가수분해물의 ACE 저해 효과가 37.
- 또한 김의 대부분 성분을 차지하는 다당류 및 고분자 단백질 등 (김, 1987)을 제거하기 위하여 김 분 말 시료에 10배의 diethylether로 24시간 처리 후 가수분해한 가수 분해액에 최종 농도가 50, 60, 70, 80 및 90%가 되도록 ethanol을 가하여 24시간 정치시킨 후 원심분리하였다. 상층액은 감압 농축 하고 동결 건조시켜 ethanol 가용성 획분 시료로 하고, 침전물은 소량의 증류수에 용해시켜 동결 건조하여 ethanol 침전 획분 시 료로 하였다.
- 색소 성분 제거를 위해 diethylether 처리를 한 후 가수분해하여 70% ethanol로 처리한 시료를 I 처리구, 9就에서 3시간 동안 교반한 후 가수분해하여 70% ethanol로 처리한 시료를 II 처리구, diethylether 처리 후 98©에서 3시간 동안 교반하고 가수분해하여 70% ethanol로 처리한 시료를 Ⅲ 처리구로 하여, 전처리 없이 가 수분해하여 70% ethanol로 처리한 대조구 시료와 ACE 저해 효과, 수율 및 peptide-nitrogen 함량을 각각 비교하였다 (Table 2).
- 6X30cm)에 주입하였다. 용매의 공급은 1 mL/min의 속도로 elution volume 500mL까지 ethanol 농도를 20%까지 직 선적으로 증가시 킨 후 다시 100 mL를 ethanol 농도 30% 까지 직 선적으로 증가시켜 10mL씩 분취하여 획분에 따라 감압 농축시켜 ACE 저해 효과를 측정하였다.
- 0X25 cm, Vy- dac) 에 주입하였다. 용매의 공급은 2mL/min의 속도로 elution volume 80mL까지 0.1% TFA를 함유한 acetonitrile(ACN)의 농도를 10%까지 직선적으로 증가시켜 2mL씩 분취하여 획분에 따라 감압 농축시켜 ACE 저해 효과를 측정하였다.
- 이 chromatogram을 elution volume 600mL까지 S1은 5개의 분 획으로, S2는 6개의 분획으로 나누어 각 분획물의 ACE 저해효과를 측정하였다. S1의 경우 10-30% ethanol 용액으로 용출시킨 분획물들을 5개의 분획 (S101~S105)으로 나누었는데 S1O1 은 ACE 저해 효과를 나타내지 않았으나 S1O2, S1O3, S1O4 및 S1O5 는 각각 81.
- 41 mg/g)는 더 낮게 나타나 ACE 저해 효과와 같은 경향을 보였다. 이상의 결과로 김 가수분해물로부터 ACE 저해 물질을 추출하기 위한 색소 제거 전처리는 diethylether로 처리한 후 가수분해한 I 처리구로 선정 하였다.
- Ultrafiltratione Turgeon and Gauthier (1990)의 방법에 따라 행하여졌다. 즉, 김 가수분해물 시료를 molecular weight cut-off가 각각 3, 000과 10, 000인 한외 여 과막(YM-3 and YM-10 membrane, DIAFLO ultrafiltration membrane, Amicon Co., Beverly, MA. USA)을 사용하여 분자량 3, 000 이하와 3, 000-10, 000 사이, 그리고 10, 000 이상으로 각각 나누어 농축시킨 후 동결 건조하여 각각의 ACE 저해 효과를 측정하였다.
- 김 가수분해물로부터 ACE 저해 물질을 효율적으로 추출하기 위한 조건을 검토하였다. 즉, 김의 주 색소 성분인 chlorophyll 및 phycobilin 등 (이와 김, 1999)을 제거하기 위하여 I 처리구는 김 분말 시료에 10배의 diethylether를 가하여 24시간 방치하였으며, II처리구는 시료에 30배의 증류수를 가하여 98t에서 3시간동안 교반, Ⅲ처리구는 diethylether 처리 후 98t에서 3시간 동안 교반 시킨 후 각각 가수분해하였다. 또한 김의 대부분 성분을 차지하는 다당류 및 고분자 단백질 등 (김, 1987)을 제거하기 위하여 김 분 말 시료에 10배의 diethylether로 24시간 처리 후 가수분해한 가수 분해액에 최종 농도가 50, 60, 70, 80 및 90%가 되도록 ethanol을 가하여 24시간 정치시킨 후 원심분리하였다.
- 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 peptide는 분자량이 2,000 이하인 것으로 보고 (Ariyoshi, 1993)되고 있으므로, 고분자의 poly- peptide를 제거하고 저분자 peptide만을 얻어서 이후의 분리 과정을 효율적으로 수행하기 위하여 molecular weight cut-ofl가' 각각 3, 000과 10, 000인 한외여과막을 사용하여 ultrafiltration을 실시하 였다 (Table 3). 분자량 3, 000 이하 분획물의 수율이 86.
- 한외여과물 중 ACE 저해 효과가 가장 높은 분자량의 시료 6g을 HPLC용 증류수 10mL에 녹여 0.45 pm membrane filter로 여과한 훅 Sephadex G'25 column(7><100cm)에 주입하고, 0.05M trifluoroacetic acid (TFA) 용액으로 용출시켜 20mL씩 분취하여 280nm에서 흡광도와 ACE 저해 효과를 측정하였다.
- 효소에 의한 가수분해율은 분해 조건에 따라 분해된 가수분해 물을 100©에서 10분간 중탕하여 효소를 실활시키고, 20% TCA 용액을 가수분해물과 동량 가하여 7, 000Xg로 20분간 원심분리한 후 상충액의 가용성 질소를 Kjeldahl법으로 정량하여 가수분해율 (degree of hydrolysis, DH)을 구하였다.
대상 데이터
- ACE 저해 효과 측정을 위한 Angiotensin-1 전환 효소(ACE) 는 rabbit lung acetone powder (Sigma Co., St. Louis, MO. USA) 를, 기질로는 hippuiyl-L-histidyl-L-leucine (Hip-His-Leu, Sigma Co.)을 사용하였고, 단백질 가수분해 효소는 Alcalase (Novo Co., Neumatt, Dittingen, Switzerland), bromelain (Sigma Co.), Collu- plin (Gist-brocades Co., Charlotte, NC. USA), Esperase (Novo Co.), Flavourzyme (Novo Co.), Maxazyme NNP (Gist-brocades Co.), Neutrase (Novo Co.), papain 30, 000 (Genencor Co., Rochester, NY. USA), Promod 192P (Gist-brocades Co.), Promod 194P (Biocatalysts Co., Pontypridd, Wales, UK), Protamex (Novo Co.), Sumizyme MP (新日本化學 Co.), Thermoase (Daiwa Kasei K. K. Co.)를 사용하였다.
- 9%로 ACE 저해 효과가 가장 높아 다음 분리 단계 시료로 선정되었다. S2의 경우도 마찬가지로 10~30% ethanol 용액으로 용출시켜 6개의 분획(S2O1 ~S2O6)으로 나눈 결과 이들 모두가 각각 31.7, 71.4, 84.3 91.3, 91.0, 90.2%의 ACE 저해 효과를 나타내었으며, 10~20% ethanol 용액에서 용출된 S2O4, S2O5와 S2O6가 각각 91.3%, 91.0 %, 90.2%의 높은 ACE 저해 효과를 나타내어 S1O2와 같이 다음 분리 단계 시료로 선정되었다. 다음 단계 시료로 선정된 S1O2 및 S2O4, S2O5, S2O6의 ACE IG。은 Table 5와 같이 나타나 S1 이나 S2에 비해 정제 되었다.
- 각 단계 별 column chromatography에 사용된 resine Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 와 ODS (octadecylsilica, YMC Co.)였으며, 그 외의 모든 시약 및 유기 용매는 일급 또는 특급품을, HPLC에 사용한 용매는 HPLC 등급을 사용하였다.
- 0%의 ACE 저해 효과를 나타내었다. 그 중 10~20% ethanol 용액에서 용출된 S1O2가 81.9%로 ACE 저해 효과가 가장 높아 다음 분리 단계 시료로 선정되었다. S2의 경우도 마찬가지로 10~30% ethanol 용액으로 용출시켜 6개의 분획(S2O1 ~S2O6)으로 나눈 결과 이들 모두가 각각 31.
- 본 실험에 사용한 김 (Rwp/iyra tenera, 완도산)은 서울 가락동 농수산물 시장에서 건조품을 구입하여 마쇄하고 20mesh 체로 걸 러 통과한 분말을 시료로 사용하였다.
- 0, 70S)으로 진탕항온수조에서 각각 4시간 동안 가수분해한 후 원심분리(7, 000Xg, 30분)하여 감압 여과하였다. 이 여액에 20% TCA (trichloroacetic acid)를 가하여 효소 실활 및 잔존 단백질을 침전시킨 후 다시 에서 7, 000Xg로 20분간 원심분리하여 상층 액만을 취하여 ether로써 잔존 TCA를 제거한 후 동결 건조하여 단백질 가수분해 효소 선정 시료로 사용하였다.
- 1 %로 매우 낮았다. 한편 ACE 저해 효과는 S3가 92.3%로 가장 높았으며, S2가 73.4%, S1 58.6%, S4 53.2%의 순으로 나타났으나 수율과 ACE 저해 효과를 동시에 고려하여 S1과 S2를 다음 분리 단계의 시료로 선정하였다. 시료로 선정된 S1과 S2의 ACE 电。은 각각 186.
성능/효과
- 50-90% ethanol 가용성 획분에 있어서 ACE 저해 효과는 각각 51.9, 55.0, 67.7, 65.6 그리고 62.7%로, ethanol 농도 70%에서 급격히 증가했다가 ethanol 농도가 높아짐에 따라 약간씩 감소하는 경향을 나타내었다. 이 때의 peptide-nitrogen 함량 또한 각각 3.
- 1 %）를 모아 각각 감압 농죽한 후 이동상을 바꾸어 rechromatography를 행한 결과 （Fig. 5）, S1O2V2는 2개의 획분으로, S2O6V3 는 1개의 획분 그리고 S2O6V4는 2개의 획분으로 뚜렷하게 분리되었다.
- 본 연구는 김의 Maxazyme NNP 가수분해물로부터 여러 단계의 column chromatography 및 HPLC를 통해 ACE 저해 peptide 를 분리, 정제하여 이의 분자량과 amino acid sequence를 분석하였다. ACE 저해 효과가 큰 저분자 peptide의 함량이 많은 가수분 해물을 얻기 위한 최적의 단백질 가수분해효소를 선정하기 위하여 시험한 결과, Maxazyme NNP에 의한 가수분해물의 ACE 저해 효과가 37.2%로 가장 높게 나타났다. 김의 효소 가수분해물로부터 ACE 저해peptide만을 효율적으로 분리하기 위한 추출 조건 시험에서, 색소 제거를 위해서는 diethylether 처리가, 다당류 및 고분자 단백질 제거를 위해서는 70% ethanol 처리가 각각 선정되었다.
- ACE 저해 효과가 큰 저분자 peptide의 함량이 많은 가수분해 물을 얻기 위한 가수분해 효소를 선정하기 위하여 13종의 식품 가공용 단백질 분해 효소를 시험한 결과 (Table 1), ACE 저해 효과는 6.0%에서 37.2%로 전보 (Lee et al, 1999)의 물 추출물에 비하여 활성이 높았다. 이는 담수어의 열수 추출물과 효소 가수분 해물의 ACE 저해 효과 비교시 효소 가수분해물의 ACE 저해 효과가 높다는 Kim et al.
- ACE 저해 효과와 peptide-nitrogen 함량은 모든 처리구에서 ethanol 가용성 획분이 침전 획분에 비해 높게 나타났으나, 수율은 98℃에서 3시간 동안 교반시킨 II 처리구와 Ⅲ 처리구의 경우 ethanol 가용성 획분보다 침전 획분에서 더 높게 나타났는데 이는 98t:에서 교반하는 동안 추출된 다량의 다당류들이 ethanoli 의해 침전되었기 때문으로 생각되었다 (박, 1996). Ethanol 가용성 획분을 처리구별로 비교해 보면, ether로만 처리한 I 처리구의 ACE 저해 효과는 67.7%로 대조구(69.9%)에 비해 약간 낮게 나타난 반면, 98t에서 처리한 Ⅱ, Ⅲ 처리구의 ACE 저해 효과는 각각 59.7%와 55.0%로 I 처리구에 비해 더 낮게 나타났다. 또한 peptide-nitrogen 함량도 대조구(4.
- 1 %로 가장 높았다. Peptide-nitrogen 함량은 Alcalase에 의한 가수분해물이 1.73mg/g으로 가장 높았고, 다음으로 Esperase (1.69), Thermoase (1.65), papain 30, 000 (1.50), Protamex (1.50), Maxazyme NNP (1.47), bromelain (1.43), Neutrase (1.41), Promod 194P (1.26), Sumizyme MP (1.22)의 순이 었으며 Colluplin(0.90), Ha- vourzyme(0.47), Promod 192P(0.26)등은 매우 낮게 나타났다.
- 리된 ACE 저해 peptide 획분들(S1O2V2V1P, S1O2V2V2P, S2O6 V3V1P, S2O6V4V1P 및 S2O6V4V2P)의 분자량을 ElectrosprayMass Spectrometer를 이용하여 측정하였다. S1O2V2V1P의 분자량 은 413.48 dalton으로 나타나 아미노산 3~4개로 구성된 단일 peptide's 것으로 추정되었으며, S1O2V2V2P의 경우는 분자량이 346.86 과 412.86 dalton으로 나타나 2개의 peptide가 섞여 있을 것으로 생각되었다. 또한 S2O6V3V1P의 분자량은 320.
- Elution volume 80mL까지 S1O2는 3개의 분획으로, S2O 4, S2O5 및 S2O6는 각각 5개의 분획으로 나누어 각 분획물의 ACE 저해 효과를 측정하였다. S1O2의 경우 분리된 3개의 분획물 중 S1O2V2만이 29.1 %의 ACE 저해 효과를 보였고, S2O4, S2O5 및 S2O6 분리시에는 10.8~44.1%의 ACE 저해효과를 나타내었으며 그 중 S2O6V3와 S2O6V4의 ACE 저해 효과가 각각 43.2 %와 44.1 %로 가장 높았다.
- 본 실험에서도 0.1% TFA를 함유한。~10% ACN 용액으로 용출시킨 분획물 중 ACE 저해 효과가 높은 S1O2V2（29.1%）, S2O6V3（43.2%） 및 S2O6V4（44.1 %）를 모아 각각 감압 농죽한 후 이동상을 바꾸어 rechromatography를 행한 결과 （Fig. 5）, S1O2V2는 2개의 획분으로, S2O6V3 는 1개의 획분 그리고 S2O6V4는 2개의 획분으로 뚜렷하게 분리되었다.
- 0%)가 비교적 낮은 저해율을 보였다. 가수분해율 및 pep- tide-nitrogen 함량도 효소의 종류에 따라 차이가 있었는데, 가수 분해율의 경우 Maxazyme NNP에 의한 가수분해물이 60.1 %로 가장 높았다. Peptide-nitrogen 함량은 Alcalase에 의한 가수분해물이 1.
- 결과적으로 본 실험에서 분리된 peptide들의 amino acid sequence의 경우 N-말단 아미노산 잔기는 기존의 보고된 대부분의 ACE 저해 peptide와 같은 경향을 나타내는 반면, C-말단 아미노 산 잔기는 arginine을 제외하고 asparagine이나 threonine으로 나타나 기존의 ACE 저해 peptide와는 다른 배열을 보여 주었다. 그러므로 본 실험에서 분리한 peptide들의 ACE 저해 활성을 peptide synthesizer를 이용한 화학 합성으로 알아 보고, in vivo 실험을 통하여 그 효과를 검증해야 할 것으로 사료된다.
- 김의 효소 가수분해물로부터 ACE 저해peptide만을 효율적으로 분리하기 위한 추출 조건 시험에서, 색소 제거를 위해서는 diethylether 처리가, 다당류 및 고분자 단백질 제거를 위해서는 70% ethanol 처리가 각각 선정되었다. 김가수분해물로부터 ACE 저해peptide를 분리, 정제하기 위한 첫 단계로 ultrafiltration을 한 결과, 분자량 3,000 이하 분획물의 ACE 저해 효과가 69.4%로 가장 높았으며, 이분획물을 gel filtration chromatography (Sephadex G_25), reverse-phase HPLC (ODS & Vydac CT8)및 gel permeation chromatography (Superdex Peptide HR) 와 같은 단계별 column chromatography를 행하여 최종적으로 단일 peptide peak들을 분리하였다. 이들 단일 peptide peak들의 분자량을 Electrospray-Mass Spectrometer 로 측정한 결과, 각각 413.
- 86 dalton으로 나타나 2개의 peptide가 섞여 있을 것으로 생각되었다. 또한 S2O6V3V1P의 분자량은 320.32 dalton으로 확인 되었으나, S2O6V4V1P와 S2O6V4V2P의 분자량은 확인되지 않아 이 획분들은 peptide를 비롯한 여러 물질들이 섞여 있는 혼합물일 것으로 사료되었다.
- 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 peptide는 분자량이 2,000 이하인 것으로 보고 (Ariyoshi, 1993)되고 있으므로, 고분자의 poly- peptide를 제거하고 저분자 peptide만을 얻어서 이후의 분리 과정을 효율적으로 수행하기 위하여 molecular weight cut-ofl가' 각각 3, 000과 10, 000인 한외여과막을 사용하여 ultrafiltration을 실시하 였다 (Table 3). 분자량 3, 000 이하 분획물의 수율이 86.4%로 대 부분을 차지했고 3, 000-10, 000 사이는 6.6%, 10, 000 이상 분획물은 7.0%로 매우 낮게 나타나 김 가수분해물의 대부분이 분자량 3, 000 이하의 저분자 물질인 것으로 나타났다. 이는 김이 Maxazyme (from 彻前如$ 即间屈)에 의해 저분자 물질로 가수분해 되었음을 나타내는 것으로, Matsui et al.
- 이상의 결과에서 볼 때, 효소에 따른 김 가수분해물에 있어서 ACE 저해능과 가수분해율 및 peptide 함량 사이에는 상관성이 없었다. 수율 또한 65.7~87.8% 정도로 나타났으나 가수분해율이 나 peptide-nitrogen 함량 및 ACE 저해 효과와의 상관성은 없는 것으로 나타났다. Suh et al.
- 7%로, ethanol 농도 70%에서 급격히 증가했다가 ethanol 농도가 높아짐에 따라 약간씩 감소하는 경향을 나타내었다. 이 때의 peptide-nitrogen 함량 또한 각각 3.06, 3.28, 4.33, 4.02, 3.81 mg/g으로 ACE 저해 효과와 밀접한 상호 관련성을 나타내어 김 가수분해물이 나타내는 ACE 저해 작용에는 가수분해 중에 생성된 peptide가 커다란 역할을 함을 알 수 있었다. 수율은 35.
- 4%로 가장 높았으며, 이분획물을 gel filtration chromatography (Sephadex G_25), reverse-phase HPLC (ODS & Vydac CT8)및 gel permeation chromatography (Superdex Peptide HR) 와 같은 단계별 column chromatography를 행하여 최종적으로 단일 peptide peak들을 분리하였다. 이들 단일 peptide peak들의 분자량을 Electrospray-Mass Spectrometer 로 측정한 결과, 각각 413.48(S1O2V2V1P), 346.86(S1O2V2V2P) 그리고 320.32 (S2O6V3V1P)dalton이었으며, 이들 peptide의 amino acid sequence는 N-말단으로부터 아미노산 잔기를 분석한 결과, 각각 Val-Gln-Gly-Asn, Thr-Glu-Thr 및 Phe-Arg으로 확인 되었다.
- 이상의 결과에서 볼 때, 효소에 따른 김 가수분해물에 있어서 ACE 저해능과 가수분해율 및 peptide 함량 사이에는 상관성이 없었다. 수율 또한 65.
- (1993) 은 가열한 정어리의 alkaline protease 분해물로부터 Thr-Tyr의 dipeptide를 분리하였다. 이상의 보고들과 비교할 때, 본 실험에서 분리된 peptide들의 경우 N-말단 아미노산 잔기들만이 valine, phenylalanine 및 threonine으로 일치할 뿐, C-말단 아미노산 잔 기의 배열은 이들과는 다른 종류의 것이었다. 그러나 Maruyama et al.
- 전 처리구 모두 가용성 획분이 침전 획분에 비하여 ACE 저해 효과가 높게 나타나 ACE 저해능을 가진 peptide는 저분자 물질인 것으로 생각되었다. 이는 담수어류 열수 추출물 및 효소 가수분해 물에 70% ethanol을 사용한 결과 침전 획분보다 가용성 획분에서 ACE 저해 효과가 월등히 높았다는 Kim et al.
- 효소별 ACE 저해 효과는 Maxazyme NNP에 의한 가수분해물이 37.2% 로 가장 높았으며 papain 30, 000(34.9%), Neutrase(34.3%), bromelain(34.2%), Esperase(32.8%), Alcalase(31.0%) 순으로 비교적 높은 저해율을 보였고 Promod 194P (19.9%), Thermoase (19.8%), Protamex (19.5%), Sumizyme MP (19.4%)가 그 다음 순이었으며 Colluplin (15.1%), Flavourzyme (11.7%), Promod 192P(6.0%)가 비교적 낮은 저해율을 보였다. 가수분해율 및 pep- tide-nitrogen 함량도 효소의 종류에 따라 차이가 있었는데, 가수 분해율의 경우 Maxazyme NNP에 의한 가수분해물이 60.
후속연구
- 결과적으로 본 실험에서 분리된 peptide들의 amino acid sequence의 경우 N-말단 아미노산 잔기는 기존의 보고된 대부분의 ACE 저해 peptide와 같은 경향을 나타내는 반면, C-말단 아미노 산 잔기는 arginine을 제외하고 asparagine이나 threonine으로 나타나 기존의 ACE 저해 peptide와는 다른 배열을 보여 주었다. 그러므로 본 실험에서 분리한 peptide들의 ACE 저해 활성을 peptide synthesizer를 이용한 화학 합성으로 알아 보고, in vivo 실험을 통하여 그 효과를 검증해야 할 것으로 사료된다.
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