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문제 정의
- 되었다. 본 실험에서는 이와 같이 여러 가지 효능과 함께 민간에서도 널리 식용하고 있는 강진향 추출물을 대상으로 항산화활성을 갖는 물질을 분리, 동정하고 항산화 활성을 확인함으로써 새로운 항산화제로서 사용할 수 있는 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- CHEN)은 콩과에 속하는 한약재로 한방에서는 진통(鎭痛), 지혈(止血)의 목적으로 사용되어 왔다. Rancimat method로 항산화 활성이 인정된 강진 향 75% 에탄올 추출물의 클로로포름 층을 가지고 항산화 활성 물질을 확인하기 위하여 silica gel chromatography와 thin layer chromaUography로 물질을 분리하고, mass spectrometer,'H-NMR 및 13C-NMR을 통해 순수물질을 동정하였다. 순수분리된 물질은 flavonoid 화합물 중 isoflavan 골격을 가지는mucronulatol(3(R&S)-3', 7-dihydroxy-2', 4-dimethoxyisoflavan) 로동정되었다.
- 2 mm)와 siHca gel 60(70~230 mesh)은 Merck사(USA) 제품을, 그리고용매 및 기타시약은 특급 또는 1급품을 사용하였다. Rancimat679(METHROHM AG, CH-9100 Herisau, Switzerland)를 이용하여 유지의 유도기간을 측정하였고, 순수 분리된 물질의동정을 위하여, Electron Impact/Mass(ZEOL JMS-AX5O5WA, Japan), 'H-NMR(400 MHz), 13C-NMR(100 MHz) (ZEOL JNM-LA400, Japan)을 사용하였다.
- Silica gel column chromatography하여 분리된 각 획분은 silica gel 60 F254 TLC plate에 spotting한 후 column chro matography^] 용출용매와 같은 용매계로 전개하여 UV(254 nm, 365 nm) 흡수양상 및 20% 황산용액을 분무하여 발색 시 나타나는 spot의 Rf값에 따라 column chromatography 용출물을 분취하여 항산화활성을 측정하였다.
- FC의 aluminum heating block상에서 시간당 20L의 공기를 주입하여 산화시켰다. 이때 발생하는 휘발성 산화생성물을 70mL의 증류수가 들어있는 absorption vessel에 이행시켜 double platinum foil electrode와 recorder0!] 의해 conductivity 정도를 즉정, 자동 기록된 chag]서 반응 개시의 conductivity로부터 conduc- tivity가 급격히 증가되는 시점까지를 유도기간(IP, induction period)으로 계산하여 각 추출물의 항산화 정도를 측정하였고, 동시에 추출물을 첨가하지 않은 것을 대조구로 하여 항산화 정도를 비교하여 AI로 표시하였다.
- 물질을 더욱 순도 높게 정제하고, 아울러 구조에 관한 정보를 얻기 위하여 D7-5-3을 아세틸화하였다. 얻어진 아세틸화물의 13C-NMR(100MHz, CDCl3) 및 DEPT spectrum(Fig.
- 순수 물질로 분리된 항산화 원인 물질의 농도별 처리구에synergist로서 ascorbic acid, citric acid, 8-tocopherol^- 각각200 ppm 첨가하여 돈지, 팜유, 대두유, 옥배유를 기질로 하여 synergistic effect 활성을 시험하였다.
- 클로로포름 층(18 g)을 silica gel(700g)을 이용하여 클로로포름 : 메탄올(30:1)로 현탁, 충전된 column(5.5×57cm)에서메탄올 비율을 단계적으로 증가시키는(30 :1 t 6 : 1, v/v) step- wise 용출법으로 분리하여 15개의 획분(D1~D15)을 얻었고 이 중에서 활성이 우수한 D7로부터 항산화성 물질 분리를 시도하였다.
- 한편 mucromilatol의 항산화력을 보다 상승시킬 수 있는 synergist를 찾기 위해 몇 가지 가능한 화합물을 첨가하여 항산화 효과를 비교하였다.
- 획분 D7은 다시 g헥산 : 에틸아세테이트 : n-부탄올(7 :3:1- 6:5:2, v/v) 용매 계로 silica gel column chromatography(55 g)하여 9개의 소획분(D7-1 ~D7-9)을 얻었고, 획분 D7-5는 다시 n-헥산 : 에틸아세테이트 : 메탄올(4: 3:0.5, v/v) 용매 계로 silica gel column chromatography(40 g)하여 3개의 획분(D7-5-1 ~D7-5-3)을 얻었으며, 이 중에서 항산화 효과가 있는 D7-5-3의 구조를 확인하였다.
대상 데이터
- 10% 황산 수용액을 분무하고 가열하였을 때 황색으로발색되 었다. 13C-NMR(100 MHz, CDC13) spectrum에서 산소,수소 및 다른 탄소가 결합한 벤젠탄소의 signal이 관측되었고(Fig. 1), oxy-methylene과 methoxy 탄소의 signal, 탄소와 수소로만 이루어진 methylene 및 methine 탄소의 signal이 각각 확인되었다. 이와 같은 TLC의 자외선 흡수 및 발색특성,그리고 13C-NMR 결과로부터 D7-5-3 획분은 flavonoid 화합물로 추정되었다.
- Ascorbic acid, citric acid, 3-tocopherol, butylated hydroxya- nisol(BHA) 및 butylated hydroxytoluene(BHT)는 Sigma사(USA) 제품, TLC plate(silica gel 60 F254, 두께 0.2 mm)와 siHca gel 60(70~230 mesh)은 Merck사(USA) 제품을, 그리고용매 및 기타시약은 특급 또는 1급품을 사용하였다. Rancimat679(METHROHM AG, CH-9100 Herisau, Switzerland)를 이용하여 유지의 유도기간을 측정하였고, 순수 분리된 물질의동정을 위하여, Electron Impact/Mass(ZEOL JMS-AX5O5WA, Japan), 'H-NMR(400 MHz), 13C-NMR(100 MHz) (ZEOL JNM-LA400, Japan)을 사용하였다.
- 본 실험의 주재료인 강진향은 전주 소재 한약상에서 건조된 상태의 것을 구입, 분쇄하여 사용하였다. 항산화 실험에 사용한 유지는 항산화제가 첨가되지 않은 팜유와 돈지를 (주)농심에서, 대두유 및 옥배유는 시판품(동방유량)을 구입하여 냉동(-75℃보관하며 사용하였다.
- 상태의 것을 구입, 분쇄하여 사용하였다. 항산화 실험에 사용한 유지는 항산화제가 첨가되지 않은 팜유와 돈지를 (주)농심에서, 대두유 및 옥배유는 시판품(동방유량)을 구입하여 냉동(-75℃보관하며 사용하였다.
이론/모형
- Rancimat을 이용하여, 김 둥(9)의 방법에 준하여 Antioxidant Index(AI: 각 항산화제를 첨가한 실험구의 유도기간을 무첨가구의 유도기간으로 나눈 값)로 항산화력을 측정, 비교하였다. 즉 Rancimat 반응용기에 해당 기질유지 2.
성능/효과
- 3)에서 mucronulatol의 diacetate에 해당하는 탄소 signal들이 모두 관즉되었으나, 비슷한 chemical shift를 갖는 signal들이중복되어 나타난 사실로부터 부제탄소인 3번 탄소의 입체구조가 R, S인 입체 이성질체가 혼합되어 있는 것을 알 수있었다. 'H-NMR spectrum(400MHz, CDCI3)(Fig. 4)에서도 mucranulatol의 diacetate에서 유래한 signal 들이 관측되었는데, 13C-NMR 또는'H-NMR spectrum에서의 signal들의 in- tensity로부터 2개의 이성질체는 4 : 3의 비율로 존재함이 확인되었다. 이상의 결과를 문헌(21,22)과 비교, 검토함으로써 강진향에서 분리한 항산화 활성물질은 mucronulatol(3(R&S)-3', 7- dihydroxy-2', 4-dimethoxyisoflavan)^.
- 6에서 보면 돈지의 경우와 달리 ascorbic acid나 citric acid를 첨가한 첨가구가 상승효과를 나타내었다. Mucronulatol(600 ppm)6!] 이들 synergist(200 ppm)를 첨가했을 때 무첨가구시 AI 1.42에서 AI 2.04를 나타내어 무첨가구 대비 60%의 항산화 개선 효과를 나타내었는데, 돈지에 첨가했을 때 우수한 항산화 효과를 나타내었던 8-tocopherol는 무첨가시 AI 1.42에서 AI 1.74를 나타내어 ascorbic acid, citric acid보다 항산화 효과가 뒤떨어졌다.
- 강진향 에탄올 추출물의 클로로포름층을 silica gel column chromatography, thin layer chromatography하여 최종적으로 분리한 mucronulatol(D7-5-3) 획분의 항산화력은 돈지에 200 ppm 적용시 AI는 3.82로 이는 돈지에 같은 농도로 적용한8-tocopherol(6.22), BHA(3.75), BHT(2.76)Q3)의 결과와 비교해보면, ^tocopherol에 비해서는 떨어지지만, 상업용으로 많이 사용되고 있는 BHA, BHT에 비하면 항산화 활성이 우수함을 알 수 있다.
- 이와 같은 TLC의 자외선 흡수 및 발색특성,그리고 13C-NMR 결과로부터 D7-5-3 획분은 flavonoid 화합물로 추정되었다. 더욱이 'H-NMR spectrum(400MHz, CDC13) (Fig. 1)에서도 벤젠환 유래의 signal과 oxy-methylene, meth oxy, methylene, methine 유래의 signal들이 관측되어 fla vonoid 화합물임이 확인되었다. 이 화합물의 EVMS spectrum 에서는 molecular ion peak가 m/z 302에서 관즉되어 분자량이 302로 결정되었다(Fig.
- 먼저, mucronulatol(200 ppm)^- 단독으로 돈지, 팜유, 대두유, 옥배유에 첨가하여 유지의 산화안정성을 본 결과, AI는각각 3.82, 1.22, 1.21, L07이었다. Mucnmulatol의 농도별 처리 구에 synergist 후보물질로서 ascorbic acid, citric acid, 8-tocopherol를 각각 200 ppm씩 첨가한 후 이를 돈지, 팜유, 대두유 및 옥배유에 첨가하여 유지의 산화안정성을 비교한 결과는 Fig.
- 얻기 위하여 D7-5-3을 아세틸화하였다. 얻어진 아세틸화물의 13C-NMR(100MHz, CDCl3) 및 DEPT spectrum(Fig. 3)에서 mucronulatol의 diacetate에 해당하는 탄소 signal들이 모두 관즉되었으나, 비슷한 chemical shift를 갖는 signal들이중복되어 나타난 사실로부터 부제탄소인 3번 탄소의 입체구조가 R, S인 입체 이성질체가 혼합되어 있는 것을 알 수있었다. 'H-NMR spectrum(400MHz, CDCI3)(Fig.
- 순수분리된 물질은 flavonoid 화합물 중 isoflavan 골격을 가지는mucronulatol(3(R&S)-3', 7-dihydroxy-2', 4-dimethoxyisoflavan) 로동정되었다. 이 물질에 대한 ascorbic acid, citric acid 및 δ- tocopheiol과의 synergist 효과를 비교하기 위해 돈지, 함유, 대두유, 옥배유를 기질로 하여 Rancimat 방법으로 시험한 결과,돈지에 대해서는 mucronulatol(600ppm)만 처리시 AI가 7.71, δ- tocopherQl(200 ppm)과의 병용시 AI가 10.97로 으로 1.5배의상승효과가 있었으며, 식물성 유지인 팜유에 대해서는 mucro-nulatol(600 ppm)만 처리시 AI가 1.42, ascorbic acid(200 ppm), citric acid(200ppm) 첨가시 AI가 각각 2.04, 204로 으로 약 1.5배의 상승효과를 보였으며, 대두유와 옥배유에 대해서는 뚜렷한 상승효과를 보이지 않았다.
- 1), oxy-methylene과 methoxy 탄소의 signal, 탄소와 수소로만 이루어진 methylene 및 methine 탄소의 signal이 각각 확인되었다. 이와 같은 TLC의 자외선 흡수 및 발색특성,그리고 13C-NMR 결과로부터 D7-5-3 획분은 flavonoid 화합물로 추정되었다. 더욱이 'H-NMR spectrum(400MHz, CDC13) (Fig.
후속연구
- 이는 유지의 기질 차이에 따른 항산화제의 효과가 다르다는 것(24,25)을 확인할 수 있었으며, 식물성유에는 토코페롤을 주로 하는 자연 항산화제들이 상당량 함유된 반면에 동물성지방에는 자연 항산화제들이 거의 존재하지 않는다는 사실(26)로 미루어볼 때 식물유에서는 항산화 활성 물질의 효과가 낮다고 판단되었다. 추후 분리된 항산화 물질과 각종 synergist 첨가에 의한 복잡한 식품 기질에서의 산화지연 실험을 통해 상업적인 이용을 검토할 예정이다.
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