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문제 정의
- 국내뿐만이 아니라 국제적으로도 유전자변형농산물 및 식품에 대한 검사법의 개발 및 표준화 연구가 활발히 이뤄지고 있으며 스위스와 독일에서는 식물의 유전자 발현조절부위인 cauliflower mosaic virus (CaMV) DNA의 35S 프로모터와 nopaline synthase(Nos) 유전자의 terminator를 검출하는 프라이머를 이용한 PCR 방법이 국가표준분석법으로 채택된 바 있으나 아직 국제적으로 표준화된 검사 방법은 없는 실정이다.3) 본 연구에서는 우리나라의 농산물변형농산물에 대한 표준분석법으로 채택된 polymerase chain reaction(PCR)을 이용한 유전자변형 콩의 검정법과 제초제 살포에 의한 유전자변형 콩과 콩나물의 생물검정법 (bioassay)을 확립한 결과와 함께 실제 수입되고 있는 콩의 혼종 여부도 조사하여 보고한다.
- RRS의 특이적인 PCR 프라이머를 제작하기 위하여 RRS 에 도입된 유전자 중 두 가지 생물계 유래의 유전자에 대한 특이 프라이머를 설계함으로써 RRS에 대한 프라이머 특이성을 높이고자 하였다. 따라서 RRS에 도입된 유전자 중 CaMV 유전자와페추니아의 EPSPS-CTP 유전자에 대하여 각각 정방향 프라이머 35S2A와 역방향 프라이머 CTP5A를 하였다(Fig.
- GM 콩과 non GM 콩을 구분 유통하지 않고 미국으로부터 수입할 경우 제초제 저항성 콩이 포함될 것으로 예상된다. 본 연구에서는 구분유통하지 않고 수입된 1997년산 미국 수입 콩 일부에 대흐忡 PCR, 생물검정뿐만 아니라 백립중 및 제색 등의 종실 특성 조사를 통하여 제초제 저항성 콩의 혼입유무와 동시에 품종에 대한 혼종 유무를 조사하였다. 대비품종으로는 국내산 소립종의 나물용 콩인 은하 콩과 장류(醬類)콩인 황금콩을 이용하여 수입 콩과 비교하였다.
제안 방법
- 확인하였다.') Table 1에 명시한 CaMV 35S 프로모터에 특이적인 21염기로 구성된 35S2A 프라이머와 EPSPS의 open reading frame의 3' 말단에 특이적인 EPSPS 3' 프라이머(24염기)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 크기는 약 1.
- BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열분석기기 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, US A) 로 염기서열을 결정하였다.
- RRS내 도입된 전체 유전자를 PCR 클로닝 하기 위하여 CaMV 35S 프로모터 및 EPSPS 유전자의 3' 말단부위의 프라이머 (Thbel 1)를 이용하여 94P에서 30초, 58℃ 에서 2분, 72℃에서 3분간의 반응을 35회 실시하였다. Nested PCR은 1.7 kb-PCR 산물 1 )1/을 주형으로 35S2A와 CTP5A를 50 ng씩 첨가하여 전체 20μl의 반응액으로 94℃에서 5분간 열변성 반응 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 7TC에서 30초간의 반응을 30회 실시하였다. PCR 기기는 GeneAmp® PCR system 9700(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다.
- PCR은 DNA 50 ng을 주형으로 RRS 특이 프라이머인 35S2A와 CTP5A(lable 1)를 50 ng씩 첨가하여 전체 20 B의 반응액으로 94℃에서 5분간 열변성 반응 후, 941에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초간의 반응을 30회 실시하였다. PCR 후의 산물은 2% 아가로스 젤 전기영동하고 CCD 카메라로 촬영하였다. RRS내 도입된 전체 유전자를 PCR 클로닝 하기 위하여 CaMV 35S 프로모터 및 EPSPS 유전자의 3' 말단부위의 프라이머 (Thbel 1)를 이용하여 94P에서 30초, 58℃ 에서 2분, 72℃에서 3분간의 반응을 35회 실시하였다.
- PCR은 DNA 50 ng을 주형으로 RRS 특이 프라이머인 35S2A와 CTP5A(lable 1)를 50 ng씩 첨가하여 전체 20 B의 반응액으로 94℃에서 5분간 열변성 반응 후, 941에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초간의 반응을 30회 실시하였다. PCR 후의 산물은 2% 아가로스 젤 전기영동하고 CCD 카메라로 촬영하였다.
- RRS 특이 프라이머의 감도(sensitivity). RRS 특이 프라이머인 35S2A와 CTP5A의 검출감도를 조사하기 위하여 non GM 콩과 RRS로 분리한 DNA를 혼합하여 RRS 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100%와 non GMO 즉, 0% RRS의 DNA를 조제하여 PCR을 하였다. Fig.
- PCR 후의 산물은 2% 아가로스 젤 전기영동하고 CCD 카메라로 촬영하였다. RRS내 도입된 전체 유전자를 PCR 클로닝 하기 위하여 CaMV 35S 프로모터 및 EPSPS 유전자의 3' 말단부위의 프라이머 (Thbel 1)를 이용하여 94P에서 30초, 58℃ 에서 2분, 72℃에서 3분간의 반응을 35회 실시하였다. Nested PCR은 1.
- 제초제 처리에 의한 RRS의 생물검정 . 근사미 (glyphosate) 제초제의 주성분인 glyphosate 제초제를 이용하여 저항성인 콩과 콩나물을 검정하기 위하여 원예용 상토에 콩은 파종하고 콩나물은 이식하였다. 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 약 10일이 지나면 초엽이 발달한 상태가 되며 3복엽의 본엽이 초기생 육단계를 나타내는 지점에서 제조제를 처리하였다.
- 본 연구에서는 구분유통하지 않고 수입된 1997년산 미국 수입 콩 일부에 대흐忡 PCR, 생물검정뿐만 아니라 백립중 및 제색 등의 종실 특성 조사를 통하여 제초제 저항성 콩의 혼입유무와 동시에 품종에 대한 혼종 유무를 조사하였다. 대비품종으로는 국내산 소립종의 나물용 콩인 은하 콩과 장류(醬類)콩인 황금콩을 이용하여 수입 콩과 비교하였다. 1997년산 미국 수입 콩을 파종하여 정상적으로 출현한 360 개체에 제초제를 처리한 결과 21개체가 저항성을 나타냈으며 이들 식물체의 잎으로부터 분리한 DNA에서도 PCR에 의해 RRS 특이 밴드를 확인하였다(Fig.
- 하였다. 따라서 RRS에 도입된 유전자 중 CaMV 유전자와페추니아의 EPSPS-CTP 유전자에 대하여 각각 정방향 프라이머 35S2A와 역방향 프라이머 CTP5A를 하였다(Fig. 1A). Non GM 콩과 RRS 콩으로부터 분리한 DNA를 각각 주형으로 35S2A 및 CTP5A 프라이머를 이용하여 PCR한 결과 Fig.
- 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 10일이 되면 라운드업 (glyphosate) 액제를 물로 희석하여 1%로 조제한 100 ml 의 라운드업 제초제를 500개체에 엽면 살포하였다. 살포 10일 후 저항성과 감수성 여부를 확인하였다.
- vortex로 혼합한 후, 65℃ 수조에서 30분-!시간 항온 처리하였다. CIAB 완충용액은 DNA 추출용액 (6.
- 시료의 마쇄는 종자 또는 건조시료를 분쇄기 (miller)를 이용하여 가능한 미세하게 분쇄하고 분쇄 후의 분말시료는 40 mesh (망목 500μm)의 체를 통과시켜 동일한 입자크기와 균질성을 확보하였다.
- 5%까지 RRS 특이 밴드의 검출되었다. 콩나물의 경우에는 RR 콩나물과 non GM 콩나물의 건조분말을 혼합하여 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10%로 조제한 후 각각의 DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 콩나물의 경우에도 0.
- 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 10일이 되면 라운드업 (glyphosate) 액제를 물로 희석하여 1%로 조제한 100 ml 의 라운드업 제초제를 500개체에 엽면 살포하였다. 살포 10일 후 저항성과 감수성 여부를 확인하였다.
- 근사미 (glyphosate) 제초제의 주성분인 glyphosate 제초제를 이용하여 저항성인 콩과 콩나물을 검정하기 위하여 원예용 상토에 콩은 파종하고 콩나물은 이식하였다. 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 약 10일이 지나면 초엽이 발달한 상태가 되며 3복엽의 본엽이 초기생 육단계를 나타내는 지점에서 제조제를 처리하였다. 처리결과는 1% glyphosate 제초제를 잎 전체에 골고루 살포한 후 3~4일부터 제초제의 효과가 나타나기 시작하였으며 10일이 지나면서 제초제 저항성과 감수성을 뚜렷이 확인할 수 있다(Fig.
대상 데이터
- 수입 콩의 특성조사에 사용한 콩은 1997년 미국산이며 1998년 국내로 농산물유통공사를 통해 수입된 3종을 사용하였다. 국내산 non GM 콩은 장류콩인 황금콩과 소립종으로 콩나물용 콩인 은하콩을 농업과학기술원 유전자원과 종자은행으로부터 분양받아 이용하였다. 시료조제를 위해 콩나물은 AG2702 및 A3244 종자를 각각 젖은 페이퍼타올 위에 올려 놓고 공기가 잘 통하도록 구멍을 뚫은 높이 25 cm, 두께 0.
- 수입 콩의 특성조사에 사용한 콩은 1997년 미국산이며 1998년 국내로 농산물유통공사를 통해 수입된 3종을 사용하였다. 국내산 non GM 콩은 장류콩인 황금콩과 소립종으로 콩나물용 콩인 은하콩을 농업과학기술원 유전자원과 종자은행으로부터 분양받아 이용하였다.
- 국내산 non GM 콩은 장류콩인 황금콩과 소립종으로 콩나물용 콩인 은하콩을 농업과학기술원 유전자원과 종자은행으로부터 분양받아 이용하였다. 시료조제를 위해 콩나물은 AG2702 및 A3244 종자를 각각 젖은 페이퍼타올 위에 올려 놓고 공기가 잘 통하도록 구멍을 뚫은 높이 25 cm, 두께 0.2 mm 정도의 비닐을 이용하여 잘 말아 세워 5cm 정도 높이의 물에 잠기도록 하여 25℃ 암조건에서 재배한 후, 물로 잘 세척하여 60℃에서 하룻밤동안 건조한 후 마쇄하여 DNA 분리에 사용하였다.
- 제초제저항성 콩 및 non GM 콩 각각 500립과제초제저항성 콩으로 만든 콩나물 및 non GM 콩나물 500g을 원예용 상토를 넣은 파종상자(가로 60cm×세로 50cm×높이 10 cm)에 균일하게 파종 또는 이식하여 251 내외의 온실에서 재배하였다. 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 10일이 되면 라운드업 (glyphosate) 액제를 물로 희석하여 1%로 조제한 100 ml 의 라운드업 제초제를 500개체에 엽면 살포하였다.
성능/효과
- 그런데 토양세균인 Agrobacterium CP4 균주는 glyphosate에 내성을 가지므로 이 CP4 유래의 EPSPS 효소유전자를 콩에 형질전환하여 glyphosate 저항성을 유도함으로써 제초제 저항성 콩(Roundup Ready Soybean, RRS)이 개발되었다.1) 이 RRS는 1996년 이후 현재에 이르기까지 다양한 품종으로 미국에서 재배되는 콩의 60% 이상을 차지하고 있으며 국내에서도 식품으로서의 안전성이 승인됨에 따라 상품화가 가능하며 이미 수입 . 유통되고 있는 실정이다 2).
- 대비품종으로는 국내산 소립종의 나물용 콩인 은하 콩과 장류(醬類)콩인 황금콩을 이용하여 수입 콩과 비교하였다. 1997년산 미국 수입 콩을 파종하여 정상적으로 출현한 360 개체에 제초제를 처리한 결과 21개체가 저항성을 나타냈으며 이들 식물체의 잎으로부터 분리한 DNA에서도 PCR에 의해 RRS 특이 밴드를 확인하였다(Fig. 5). 또한 한진, 풀뷰티, 나차나리 3종의 수입 콩으로부터 낱알 단위로 각각의 DNA를 분리하여 RRS 특이프라이머를 이용하여 KR 분석한 결과, 3종으로부터 모두 제초제저항성 유전자가 검출되었다(Fig.
- 1). 35S2A와 CTP5A 프라이머를 이용한 RRS 특이 유전자단편의 염기서열을 분석한 결과 PCR 산물의 크기는 330bpS RRS 특허 정보의 CaMV 35S 프로모터와 EPSPS- CTP 유전자의 염기서열과 완전히 일치함을 확인하였다(Fig. 3). 또한 PCR 대조구로 콩의 내재유전자인 lectin 유전자의 특이 프라이머 (Table 1)를 이용한 경우에는 RRS 및 non GM 콩 양쪽 모두에서 118 bp로 예상되는 lectin 유전자 특이 DNA 밴드가 검출되었다(Fig.
- 5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100%와 non GMO 즉, 0% RRS의 DNA를 조제하여 PCR을 하였다. Fig. 2와 같이 RRS 특이적인 330 bp의 PCR 산물은 0.1% RRS까지 검출이 가능하였고 콩 내재유전자인 lectin 특이 PCR 산물인 118 bp의 밴드는 non GM 콩 및 여러 비율로 혼합된 각각의 RRS DNA에서 모두 동일하게 검출되었다. 또한 RRS 및 lectin 특이 프라이머를 동시에 적용한 duplex PCR에서도 0.
- 1A). Non GM 콩과 RRS 콩으로부터 분리한 DNA를 각각 주형으로 35S2A 및 CTP5A 프라이머를 이용하여 PCR한 결과 Fig. 2에서와 같이 RRS DNA를 주형으로 한 경우에 330 bp의 밴드가 검출이 되었고 non GM 콩 DNA를 주형으로 한 경우에는 검출되지 않았다. 또한 동일 프라이머를 이용하여 L7kb의 PCR 산물을 주형으로 한 nested PCR 에서도 330 bp의 PCR 산물이 검출되었다(Fig.
- ') Table 1에 명시한 CaMV 35S 프로모터에 특이적인 21염기로 구성된 35S2A 프라이머와 EPSPS의 open reading frame의 3' 말단에 특이적인 EPSPS 3' 프라이머(24염기)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 크기는 약 1.7 kb였으며 염기서열 분석으로 Fig. 1에서와 같이 CaMV35S 프로모터영역 일부와 페추니아 EPSPS 유전자의 엽록소 전이 펩티드EPSPS 유전자 전체가 분리되었음이 확인되었고 또한 RRS 특허정보의 페추니아 EPSPS-CTP 유전자와 CP4-EPSPS 유전자의 염기서열과도 일치하는 결과를 얻었다(결과 미제시).
- 1% RR 콩나물까지 RRS 특이 PCR 산물인 330bp의 DNA 밴드 검출되었다. RRS 특이 프라이머의 PCR 검출감도는 DNA 추출방법에서 본 연구의 CTAB 법을 다소 변형하여 실리카겔 resin 또는 membrane 등을 이용하여 고순도로 정제하여 얻은 콩 DNA에서는 001%까지 검출이 가능하였다(결과 미제시).' 이러한 PCR 검출 감도는 PCR에 사용한 DNA의 순도 및 양, 프라이머의 특이성에 따라 다르게 나타나며 고감도 검출의 경우 0.
- RRS에 도입된 제초제 저항성 유전자를 PCR 분리하기 위하여 RRS의 특허정보로부터 제초제 저항성 유전자(EPSPS)의 발현조절부위가 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV)의 35S 프로모터와 nopaline synthase(NOS)의 터미네이터로 구성되어 있음을 확인하였다.') Table 1에 명시한 CaMV 35S 프로모터에 특이적인 21염기로 구성된 35S2A 프라이머와 EPSPS의 open reading frame의 3' 말단에 특이적인 EPSPS 3' 프라이머(24염기)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 3). 또한 PCR 대조구로 콩의 내재유전자인 lectin 유전자의 특이 프라이머 (Table 1)를 이용한 경우에는 RRS 및 non GM 콩 양쪽 모두에서 118 bp로 예상되는 lectin 유전자 특이 DNA 밴드가 검출되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 35S2A와 CTP5A가 RRS에 특이적인 PCR 프라이머로서 PCR을 이용한 RRS 검정에 효과적으로 사용할 수 있음을 시사한다.
- 1% RRS까지 검출이 가능하였고 콩 내재유전자인 lectin 특이 PCR 산물인 118 bp의 밴드는 non GM 콩 및 여러 비율로 혼합된 각각의 RRS DNA에서 모두 동일하게 검출되었다. 또한 RRS 및 lectin 특이 프라이머를 동시에 적용한 duplex PCR에서도 0.5%까지 RRS 특이 밴드의 검출되었다. 콩나물의 경우에는 RR 콩나물과 non GM 콩나물의 건조분말을 혼합하여 0.
- 소립종인 경향을 나타냈다. 또한 제색은 대비품종으로 이용된 콩은 모두 황색임에 비하여 수입 콩은검정색, 갈색, 황색 등으로 다양하게 나타났다(Fig. 6). 이는 여러 품종이 혼종되어 수입되고 있음을 나타내는 것으로서 앞으로 국산콩의 육종방향을 유색종피이며, 극소립 및 극 대립종으로 추진한다면 수입 콩과 차별화할 수 있는 하나의 방법으로서 고려될 수 있을 것이다.
- 5). 또한 한진, 풀뷰티, 나차나리 3종의 수입 콩으로부터 낱알 단위로 각각의 DNA를 분리하여 RRS 특이프라이머를 이용하여 KR 분석한 결과, 3종으로부터 모두 제초제저항성 유전자가 검출되었다(Fig. 5). Table 2는 수입 콩의 종실특성과 발아율 등을 나타낸 것으로 발아율은 78-90% 정도로 나타났고, 100립중은 대비품종으로 대립종인 황금콩은 25 g, 소립종인 은하콩은 12 g임에 비하여 수입 콩은 14.
- 2). 이러한 결과는 35S2A와 CTP5A가 RRS에 특이적인 PCR 프라이머로서 PCR을 이용한 RRS 검정에 효과적으로 사용할 수 있음을 시사한다.
- 4). 이와 같은 제초제 처리에 의한 생물검정 방법은 제초제 처리 전의 전체 발아 개체수에 대하여 제초제 처리 후의 저항성 개체 수의 비율로부터 GMO의 혼입율 산출이 가능하므로 저비용으로 GMO 혼입률을 확인하거나 유전자변형 콩의 모니터링에 이용이 가능할 것으로 생각되었다.
- 콩은 출현 후, 콩나물은 이식 후 약 10일이 지나면 초엽이 발달한 상태가 되며 3복엽의 본엽이 초기생 육단계를 나타내는 지점에서 제조제를 처리하였다. 처리결과는 1% glyphosate 제초제를 잎 전체에 골고루 살포한 후 3~4일부터 제초제의 효과가 나타나기 시작하였으며 10일이 지나면서 제초제 저항성과 감수성을 뚜렷이 확인할 수 있다(Fig. 4). 이와 같은 제초제 처리에 의한 생물검정 방법은 제초제 처리 전의 전체 발아 개체수에 대하여 제초제 처리 후의 저항성 개체 수의 비율로부터 GMO의 혼입율 산출이 가능하므로 저비용으로 GMO 혼입률을 확인하거나 유전자변형 콩의 모니터링에 이용이 가능할 것으로 생각되었다.
후속연구
- 6). 이는 여러 품종이 혼종되어 수입되고 있음을 나타내는 것으로서 앞으로 국산콩의 육종방향을 유색종피이며, 극소립 및 극 대립종으로 추진한다면 수입 콩과 차별화할 수 있는 하나의 방법으로서 고려될 수 있을 것이다.
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