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문제 정의
- 솔잎(17-20)은 예로부터 중풍을 예방하고 간장질환, 위장질환, 신경계 질환 등에 대한 효과와 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병과 같은 노화 관련 질환을 예방하는 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 항균 효과 또한 뛰어난 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 연구에서는 천연 보존료 개발의 일환으로 식품 및 식품제조 환경 에서 문제가 되고 있는 Listeria monoiyfogenes의 성 장억 제 방안을 모색하고자 소나무 에탄올 추출물을 이용하여 식중독 세균인 Listeria monocytogenes 에 대한항균성 여부와 농도별 성장도 검사 및 전자현미경을 통한 형태 관찰 등을 조사하였다.
제안 방법
- 24시간 배양한 Listeria monocytogenes 3균주를 ether, ethyl acetate, butanol 분획물 40mg/mL을 100 mL tryptic soy broth(TSB)에 log 4~5 CFU/mL를 접종하여 35℃에서 12시 간 배양한 후 pour plate method(22)로 TSA에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 형성된 colony수를 대조구와 비교하였다.
- 24시간 배양한 Listeria monocytogenes 3균주를 소나무 에탄올 추출물을 0 mg/mL, 4 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL 을 100 mL tryptic soy broth(TSB)에 접종하여 35℃에서 배양하면서 시 간경과에 따른 생균수의 변화를 pour plate method (22)로 TSA에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 형성된 colony수를 계측하였다.
- 주사전자현미경 (Scanning Eelectron Micro-scope(SEM), Akashi SS-130, Japan) 관찰은 알콜로 탈수시킨 다음, isoamylacetate에 하룻밤 침지시켰다. 그 후 액체 질소를 사용하여 critical point drryei■로 건조시킨 후 ion coater 를 사용하여금으로 coating시켜 SEM으로 관찰하였다.
- 5% osmium tetoxide 용액에서 1시간 후 고정을 하였다. 다시 PB로 세척 한 후 2% agar로 block을 만들고 알콜 시리즈(50, 70, 80, 90, 95, 100%)를 사용하여 순차적으로 탈수시킨 다음 polybed araidite resin으로 포매하였다. 이렇게 만든 block sample을 LKB ultratome IV microtome으로 section하여 이를 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope(TEM), H-7600, Japan) 관찰하였다.
- 소나무 에탄올 추출물에 의한 세균의 손상 여부를 관찰하기 위하여 Listeria monocytogenes 3 균주 배양액을 소나무 에탄올 추출물 40 mg/mL를 첨가시킨 100 mL TSB 에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 균을 원심분리하여, 상 등액은 버리고 pellete 0.05 M phosphate buffer(PB) 에서 2.5% glutaraldehydee 4℃에서 2시간 전 고정하였다. 냉장 보관된 동일한 buffer로 2~3회 세척하고 PB로 실온에서 0.
- 저온에서 성장이 가능한 식중독 병원성 미생물인 Listeria 가 육이나 우유 등의 낙농제 품에 오염되었을 경우 심각한 문제점을 유발시킬 수 있는 점을 고려 해볼 때 소나무 에탄올 추출물의 Listeria monocytoge“爲에 대한항균 작용은 소나무 에탄올 추출물의 식품 보존제로서의 사용 가능성을 확인하고 이에 대한 연구는 앞으로 좀 더 세부적인 연구가 선행되어야 할 것으로 추정되었다. 소나무 에탄올 추출물의 Listeria 脈s에 대한 항균력이 세포의 성장단계 중 어느 단계에서 강한가를 알아보기 위해 배양 4시간, 8시간, 12시간, 24시간째 각각 균체를 회 수하여 소나무추출물을 40 mg/mL 함유한 TSB에 접 종하여 35℃에서 3시간 배양한 후 생균수의 변화를 대조구와 비교한 결과 Table 2에서 보는 바와 같다. Listeria monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes Brie I 및 Listeria monocytogenes ATCC 19111 3 균주 모두 공히 4시간째 회수한 균체에서 생균수 감소 현상이 높이 확인되었으며 이는 균체의 성장단계 중 유도기에서 대수적 증식기나 정지기보다 항균성 물질이나 외부 자극에 더욱 민감하게 작용하여 발육이 불가능하게 되어 긴 잠복기간이 필요하다고 판단되었으며 또한 소나무의 항균력이 강하게 영향을 미쳐 접종균 중 약간의 변이 균이 증식하여 균의 성장이 억제 혹은 사멸하는 현상을 나타내었다고 추정되었다.
- 소나무 에탄올 추출물이 시험 균주의 생육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 소나무에 탄올 추출물을 농도별 0 mg/ mL, 4 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL을 첨가한 TSB에 Listeria monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes Brie I, Listeria monocytogenes ATCC 19111 3 균주의 소나무 에탄올 추출물 농도별 첨가에 따른 배양시간별 성장검사를 한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같다. Listeria monocytogenes 3균주의 성장억제 정도는 균주에 따라 다소 다른 경향을 나타내었으나 4 mg/mL 첨가구는 모든 시험 균주가 대조구에 비중 H 서 전 배양 기간 동안 성장억제 경향을 나타내었으며 20 mg/mL, 40 mg/mL 첨가구는 현저한 생육 저해 효과를 나타냈다.
- 소나무 추출물의 Listeria monocytogenes의 성장단계별 항균력 을 조사하기 위하여 24시간 전 Listeria monocytogenes 3균주를 TSB에 배양하면서 4시간, 8시간, 12시간, 24시 간째 각각 균주를 회수한 후 소나무에 탄올 추출물을 40 mg/mL을 100 mL TSB에 접종하여 35℃에서 3시간 배 양한 후 생균수의 변화를 대조구와 비교하였다.
- 다시 PB로 세척 한 후 2% agar로 block을 만들고 알콜 시리즈(50, 70, 80, 90, 95, 100%)를 사용하여 순차적으로 탈수시킨 다음 polybed araidite resin으로 포매하였다. 이렇게 만든 block sample을 LKB ultratome IV microtome으로 section하여 이를 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope(TEM), H-7600, Japan) 관찰하였다. 주사전자현미경 (Scanning Eelectron Micro-scope(SEM), Akashi SS-130, Japan) 관찰은 알콜로 탈수시킨 다음, isoamylacetate에 하룻밤 침지시켰다.
- 이렇게 만든 block sample을 LKB ultratome IV microtome으로 section하여 이를 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope(TEM), H-7600, Japan) 관찰하였다. 주사전자현미경 (Scanning Eelectron Micro-scope(SEM), Akashi SS-130, Japan) 관찰은 알콜로 탈수시킨 다음, isoamylacetate에 하룻밤 침지시켰다. 그 후 액체 질소를 사용하여 critical point drryei■로 건조시킨 후 ion coater 를 사용하여금으로 coating시켜 SEM으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 균주는 미국 조지아 대학 식품공학과에서 분양받은 Listeria monocytogenes Scott A와 Listeria monocytogenes Brie I 그리고, 한국종균협회에서 분양받은 Listeria monocytogenes ATCC 19111을 tryptic soy broth (TSB, Difco)에 접종하여 35℃에서 24시간 2회 계대 배양하여 사용하였다.
- 해인사에서 채취한 소나무를 정선, 세척분쇄하여 냉각 응축기가 설치된 삼각플라스크에 시료와 에탄올을 1: 9(W/V) 의 비율로 넣고 상온에서 24시간 동안 추출한 다음, 여과 시켜 얻은 액을 회전진공증발기(Heidoiph WB 2000)로 최초량의 1/9로 농축하여 membrane filter(Whatman, No. 2)로 여과하고 멸균처리하여 에탄올 추출 원액으로 사용하였다.
이론/모형
- 에탄올로 추출한 소나무 추출물을 methanol과 HQ를 사용하여 녹인 후 ether 분획물, ethyl acetate 분획물 및 butanol 분획물을 사용하여 Lee와 Yim⑸의 방법에 의해 Fig. 1과 같은 방법으로 용매분획을 실시하였다.
성능/효과
- 2에서 보는 바와 같다. Listeria monocytogenes 3균주의 성장억제 정도는 균주에 따라 다소 다른 경향을 나타내었으나 4 mg/mL 첨가구는 모든 시험 균주가 대조구에 비중 H 서 전 배양 기간 동안 성장억제 경향을 나타내었으며 20 mg/mL, 40 mg/mL 첨가구는 현저한 생육 저해 효과를 나타냈다. 이때 첨가된 에탄올에 의한 생육 저해 영향를 알아보기 위하여 실험 배지에 에탄올을 1% 첨가하여 배양한 결과 1% 에탄올에 의한 균 증식 억제 현상은 나타나지 않았다.
- 소나무 에탄올 추출물의 Listeria 脈s에 대한 항균력이 세포의 성장단계 중 어느 단계에서 강한가를 알아보기 위해 배양 4시간, 8시간, 12시간, 24시간째 각각 균체를 회 수하여 소나무추출물을 40 mg/mL 함유한 TSB에 접 종하여 35℃에서 3시간 배양한 후 생균수의 변화를 대조구와 비교한 결과 Table 2에서 보는 바와 같다. Listeria monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes Brie I 및 Listeria monocytogenes ATCC 19111 3 균주 모두 공히 4시간째 회수한 균체에서 생균수 감소 현상이 높이 확인되었으며 이는 균체의 성장단계 중 유도기에서 대수적 증식기나 정지기보다 항균성 물질이나 외부 자극에 더욱 민감하게 작용하여 발육이 불가능하게 되어 긴 잠복기간이 필요하다고 판단되었으며 또한 소나무의 항균력이 강하게 영향을 미쳐 접종균 중 약간의 변이 균이 증식하여 균의 성장이 억제 혹은 사멸하는 현상을 나타내었다고 추정되었다. 유도기는 세포가 발육을 재개할 수 있는 농도에 도달할 때까지 효소나 중간대사물질이 축적되는 시기로 소나무 추출물의 항균성 물질에 의해 대사 효소의 활성 억제, 단백질 합성 등에 영향을 미쳐 정상적인 세포로 성장하지 못하고 균의 성장 저해 효과가 나타난다고 판단되었다.
- 알 수 있었다. 살균에 관여하는 기작을 확인하고 자 균체의 표면을 전자 현미경으로 관찰한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 Listeria monocytogenes Scott A의 경우 대조구의 균체 표면은 매끈하고 손상의 흔적이 없으나 처리구의 균체 의표면은 손상되었거나 형태가 이상을 일으킨 모습을 볼 수 있었으며 다른 2균주 Listeria monocytogenes Brie I과 Listeria monocytogenes ATCC 19111도 같은 경향을 나타내었다. 이는 소나무에 탄올 추출물 40 mg/mL 첨가량에 의해 Listeria monocytogenes 균체에 이상을 일으키고 있음을 보여주고 있으며 Yim(3)이 오미자 에탄올 추출물 처리에 의해 Listeria monocytogenese] 세포막이 파괴되어 내용량이 유출되는 현상과 유사한 경향을 나타났다.
- 소나무 에탄올 추출물을 40 mg/mL 첨가시킨 TSB에서 Listeria monocytogenes를 증식시 켰을 경우 대조 구에서는 미생물의 증식이 급격히 일어났으나 첨가구의 경우 미생물의 뚜렷한 감소 현상이 일어나는 것을 알 수 있었으며 이를 통하여 소나무 추출물이 Listeria monocytogenes 3 균주에 대한 항균 작용은 초기 접종 균 주량에 비해 균이 감소되는 것으로 보아 균의 성장 억제 라기보다는 살균에 기여한다는 것을 알 수 있었다. 살균에 관여하는 기작을 확인하고 자 균체의 표면을 전자 현미경으로 관찰한 결과 Fig.
- 높게 나타났다. 소나무 주 줄물 40 mg/mL 첨가에 의 해 Listeria monocytogenes 3 균주 모두 균체의 성장단계 중유도 기인 4시간째 회수한 균체에서 높은 생균수 감소 현상이 확인되었다. 전자 현미경으로 확인한 균체의 형태는 대조 구의 균체 표면은 매끈하고 손상의 흔적이 없으나 처리구의 균체의 표면은 손상되었거나 형태가 이상을 일으킨 모습을 볼 수 있었다.
- 소나무를 95%에 탄올로 추출하여 얻은 추출물을 40 mg/ mL 첨가하였을 때 Listeria monocytogenes Scott A, Listeria monocytogenes Brie I, Listeria monocytogenes ATCC 19111 3 균주의 성장이 억제되었으며 이를 다시 용매별로 순차 분획한 후 3균주에 대한 증식저해 효과는 특히 ether 분획물이 높게 나타났다. 소나무 주 줄물 40 mg/mL 첨가에 의 해 Listeria monocytogenes 3 균주 모두 균체의 성장단계 중유도 기인 4시간째 회수한 균체에서 높은 생균수 감소 현상이 확인되었다.
- 소나무 에탄올 추출물을 다시 극성이 다른 용매 ether, ethyl acetate, butan이로 순차분획 하여 이들 각각의 분획 추출물의 항균효과를 알아보기 위하여 분획 추출물을 TSB에 40 mg/mL 농도로 첨가하고 3균주의 Listeria momg尤를 35℃에 서 12시 간 배양한 후 생균수를 측정한 결과는 Table 1 에서 보는 바와 같이 ether 분획물이 Listeria monocytogenes 3 시험 모든 균주에 대하여 감수성은 약간 다르나 높은 항균성을 보이고 있으며 butanol 분획물은 ATCC 19111을 제외하곤 성장 억 제 경향이 나타나지 않았다. 이는 균주에 따라, 분획 물의 종류에 따라 항균력이 다소 상이하였으나 ether 분획 물이 다른 분획물보다 시험 3균주에 대해 높은 항균력을 보였으며 ethyl acetate 분획물은 특히 ATCC 19111의 경우에 항균 활성이 높게 나타났다. 천연물에서 항균성은 유효물질의 특성에 따라용매의 추출 정도가 다른 바 실험에 사용한 소나무 에탄올 추출물의 경우 항균력을 나타내는 물질은 여러 가지 물질의 복합적인 작용에 기인된다고 추정되나 유효물질이용출되 는 용매 는 ether 층이 다른 분획에 비해 유효한 것으로 나타났다.
- 하지만 추출 성분이 어느 획분에 완전히 분리되지 않고 수개 획분에 걸쳐서 나타나기 때문에 이에 따른 좀 더 구체적인 연구가 선행되어야 할 것으로 판단되었다. 이때 첨가된 유기용매 ether, ethyl acetate 및 butanol 자체 에 의한 생육 저해 영향를 알아보기 위하여 실험 배지에 유기용매 ether, ethyl acetate 및 butanol을 1% 첨가하여 배양한 결과 1% ether, ethyl acetate 및 butanol에 의한 균증식 억제 현상은 나타나지 않았다. 일반적으로 ether 층에는 lipids, essential oil, 색소 등과 같은 성분이 추출되며 , Lee와 Yim(4)은 오미 자 추출물의 ether, ethyl acetate 및 butanol 분획 물이 Listeria monocytogenes 3^^°]] 대해 강한 항균 효과가 인정되 었다고 보고 하였다.
- 소나무 주 줄물 40 mg/mL 첨가에 의 해 Listeria monocytogenes 3 균주 모두 균체의 성장단계 중유도 기인 4시간째 회수한 균체에서 높은 생균수 감소 현상이 확인되었다. 전자 현미경으로 확인한 균체의 형태는 대조 구의 균체 표면은 매끈하고 손상의 흔적이 없으나 처리구의 균체의 표면은 손상되었거나 형태가 이상을 일으킨 모습을 볼 수 있었다.
- 이는 균주에 따라, 분획 물의 종류에 따라 항균력이 다소 상이하였으나 ether 분획 물이 다른 분획물보다 시험 3균주에 대해 높은 항균력을 보였으며 ethyl acetate 분획물은 특히 ATCC 19111의 경우에 항균 활성이 높게 나타났다. 천연물에서 항균성은 유효물질의 특성에 따라용매의 추출 정도가 다른 바 실험에 사용한 소나무 에탄올 추출물의 경우 항균력을 나타내는 물질은 여러 가지 물질의 복합적인 작용에 기인된다고 추정되나 유효물질이용출되 는 용매 는 ether 층이 다른 분획에 비해 유효한 것으로 나타났다. 하지만 추출 성분이 어느 획분에 완전히 분리되지 않고 수개 획분에 걸쳐서 나타나기 때문에 이에 따른 좀 더 구체적인 연구가 선행되어야 할 것으로 판단되었다.
후속연구
- 일반적으로 ether 층에는 lipids, essential oil, 색소 등과 같은 성분이 추출되며 , Lee와 Yim(4)은 오미 자 추출물의 ether, ethyl acetate 및 butanol 분획 물이 Listeria monocytogenes 3^^°]] 대해 강한 항균 효과가 인정되 었다고 보고 하였다. 저온에서 성장이 가능한 식중독 병원성 미생물인 Listeria 가 육이나 우유 등의 낙농제 품에 오염되었을 경우 심각한 문제점을 유발시킬 수 있는 점을 고려 해볼 때 소나무 에탄올 추출물의 Listeria monocytoge“爲에 대한항균 작용은 소나무 에탄올 추출물의 식품 보존제로서의 사용 가능성을 확인하고 이에 대한 연구는 앞으로 좀 더 세부적인 연구가 선행되어야 할 것으로 추정되었다. 소나무 에탄올 추출물의 Listeria 脈s에 대한 항균력이 세포의 성장단계 중 어느 단계에서 강한가를 알아보기 위해 배양 4시간, 8시간, 12시간, 24시간째 각각 균체를 회 수하여 소나무추출물을 40 mg/mL 함유한 TSB에 접 종하여 35℃에서 3시간 배양한 후 생균수의 변화를 대조구와 비교한 결과 Table 2에서 보는 바와 같다.
- 천연물에서 항균성은 유효물질의 특성에 따라용매의 추출 정도가 다른 바 실험에 사용한 소나무 에탄올 추출물의 경우 항균력을 나타내는 물질은 여러 가지 물질의 복합적인 작용에 기인된다고 추정되나 유효물질이용출되 는 용매 는 ether 층이 다른 분획에 비해 유효한 것으로 나타났다. 하지만 추출 성분이 어느 획분에 완전히 분리되지 않고 수개 획분에 걸쳐서 나타나기 때문에 이에 따른 좀 더 구체적인 연구가 선행되어야 할 것으로 판단되었다. 이때 첨가된 유기용매 ether, ethyl acetate 및 butanol 자체 에 의한 생육 저해 영향를 알아보기 위하여 실험 배지에 유기용매 ether, ethyl acetate 및 butanol을 1% 첨가하여 배양한 결과 1% ether, ethyl acetate 및 butanol에 의한 균증식 억제 현상은 나타나지 않았다.
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